氢离子焦磷酸化酶基因VP1调控植物抗逆反应的分子机制解析及在小麦中的应用研究

摘要

氢离子焦磷酸化酶（H+-PPase）是植物重要的质子转运体蛋白，它以焦磷酸（PPi）为底物将其水解为2个磷酸，同时生成能量，并与质子（H+）跨膜运输过程耦联，在另一种质子转运蛋白氢离子ATP酶（H+-ATPase）协同下将胞质中的H+转运入液泡中或胞外，在膜内外维持一定的质子梯度，为离子和其它溶质的次级主动运输提供动力。现有文献报道在植物中过表达不同来源的H+-PPase基因可以促进植物根系发育，显著提高植物的抗旱性、耐盐性、耐低磷胁迫的能力，证明H+-PPase在植物生长发育、抗逆反应、营养物质利用等方面发挥着重要的作用，但目前关于H+-PPase的研究主要集中在基因功能及生理机制研究方面，其相关的信号途径及分子调控机制鲜有报道。因此，筛选与H+-PPase互作的蛋白并研究其互作蛋白的功能对于揭示H+-PPase的分子调控机制具有重要的意义。
　　文献报道拟南芥的H+-PPase基因AVP1可以显著提高植物的抗逆性。本研究以拟南芥AVP1为诱饵采用膜蛋白酵母双杂交系统筛选拟南芥cDNA文库，获得一批与AVP1互作的蛋白。其中，酵母互作试验验证了三个互作蛋白包括小 GTP结合蛋白 AtRAB、蛋白激酶AtAZK、受体蛋白激酶 AtRLK与AVP1的互作关系。双分子荧光互补实验（BiFC）证明AVP1和上述三个蛋白能在细胞膜或/和细胞核上发生相互作用。拟南芥基因表达数据库数据显示AVP1和互作蛋白AtRAB都受到渗透、高盐和干旱等胁迫的诱导表达。以AVP1三个互作蛋白的拟南芥突变体rab、azk、rlk和AVP1的拟南芥突变体avp1为实验材料，分别进行ABA、高盐、低磷、低钾胁迫的处理，比较这些突变体与野生型拟南芥（WT）的表型，分析这些 AVP1互作蛋白基因在非生物胁迫条件下的功能。结果显示：1、在 ABA处理条件下，突变体rab的表型与avp1类似，相对于WT都表现为根长缩短，证明AtRAB与AVP1都参与ABA信号途径。在低磷处理条件下，突变体rab与突变体avp1的表型类似，相对于WT都表现于根系生长受到抑制，证明AtRAB与AVP1都正向调控植物的低磷胁迫响应。2、在高盐处理条件下，突变体azk和突变体avp1表型类似，相对于WT都表现为根系生长受到抑制，说明AtAZK和AVP1在植物耐盐反应中都起正向作用。3、在低钾处理条件下，突变体rab、突变体rlk对低钾处理的反应同突变体avp1较为类似，其中，突变体rlk对低钾胁迫更为敏感，说明AtRLK和AVP1正向调控植物对低钾胁迫的响应。总之，在ABA和低磷处理条件下，AtRAB和AVP1突变体表型类似；在高盐处理条件下，AtAZK和AVP1突变体表型类似；在低钾处理条件下，AtRLK和AVP1表型类似，结合这些互作蛋白与AVP1互作关系的验证结果初步推测三个互作蛋白AtRAB、AtAZK、AtRLK与AVP1处于相同信号途径中，参与AVP1在不同胁迫条件下的分子调控，影响植物对高盐、低磷和低钾胁迫的抗性。
　　本研究前期工作为了筛选新的H+-PPase基因用于小麦抗逆遗传改良，从小麦近缘植物披碱草中克隆新的H+-PPase基因EdVP1，在烟草中过表达EdVP1基因可以显著改良其耐高盐及低钾胁迫的能力，进而采用基因枪法将 EdVP1基因转化小麦品种郑147。本研究利用转 EdVP1基因小麦为实验材料，在郑州国家土壤肥力长期定位实验地进行田间养分吸收实验，鉴定转基因小麦对低磷、低钾、低氮等不同养分胁迫的作用。试验结果表明，转EdVP1基因的小麦植株能在一定程度上提高小麦的产量，同时能够促进小麦株系对肥料的利用率。在不施肥及施NPK条件下，转基因株系比受体提高了分蘖数，差异达到显著水平。在不同施肥处理条件下，转基因株系的单株穗粒数都有较大提升，与受体相比差异都达到了极显著水平。在大部分施肥处理条件下，转基因植株的亩产都比受体要高，多数差异达到极显著水平。转基因小麦材料的千粒重与受体郑147差异不大。转基因株系和受体的单株主茎小穗数差异不大，却明显比受体的不育小穗数少，这可能是因为转基因提升了植株的小穗可育性，在千粒重和单株穗数提升不明显的情况下使转基因植株单株穗粒数提升，是最终产量提升的原因。
　　综上所述，通过本研究在拟南芥中明确了H+-PPase相关的信号途径，阐明了H+-PPase基因调控的分子机制。同时，通过比较转H+-PPase类基因（EdVP1）小麦和受体在不同低营养胁迫条件下的营养利用效率和产量差异，明确了 EdVP1基因的功能，为作物抗逆分子育种提供了新的基因资源。

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中文摘要

1 文献综述

1.1 H+-PPase的属性和分子结构

1.2 H+-PPase的功能

1.3 H+-PPase对逆境胁迫的响应

2 引言

3 材料与方法

3.1 实验材料

3.2 采用膜蛋白酵母双杂交系统筛选拟南芥cDNA文库

3.3 采用泛素分离系统在酵母中验证相关基因与AVP1的互作

3.4 AVP1与互作蛋白的亚细胞定位和荧光双分子互补（BiFC）互作验证

3.5 拟南芥突变体avp1和rab、azk、rlk的纯合体鉴定

3.6 拟南芥突变体avp1和rab、azk、rlk的外源ABA和 NaCl处理

3.7 拟南芥突变体avp1和rab、azk、rlk的低磷、低钾营养处理

3.8 ABA和低磷、低钾处理下拟南芥WT和突变体avp1、rab、azk、rlk中相关基因的表达量变化

3.9 EdVP1促进小麦对肥料的吸收利用以及对产量和品质的影响

4 结果与分析

4.1 膜蛋白酵母双杂交系统筛选拟南芥cDNA文库

4.2 泛素分离系统在酵母中验证蛋白与AVP1的互作

4.3 AVP1及互作蛋白的亚细胞定位和双分子荧光互补（BiFC）

4.4 AVP1和AtRAB的表达谱分析

4.5 拟南芥突变体纯合鉴定

4.6 分别对AZK、RLK、RAB、AVP1的拟南芥纯合突变体进行ABA、NaCl、低磷、低钾处理，观察表型变化

4.7 拟南芥野生型WT、突变体avp1和rab中ABA相关基因表达量的变化

4.8 EdVP1对小麦产量和品质的影响以及对肥料的高效利用

5 结论与讨论

参考文献

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