不同类型玉米籽粒发育早期和胚关键差异蛋白挖掘与分析

摘要

早期籽粒发育是籽粒形成的基础。而胚又是籽粒发育最重要的部分。本研究在已有研究工作的基础上，以粒重差异明显的大粒普通玉米自交系丹232和小粒爆裂玉米自交系N04为材料，选取授粉后0d、4d和6d三个时期的完整籽粒和授粉后20d、33d、46d的胚，利用双向电泳等技术分析同一材料不同时期和不同材料同一时期差异表达蛋白，确定影响玉米籽粒早期发育与胚发育的关键蛋白及其功能，并对目标基因在不同材料和时期的表达情况进行分析，同时对两个基因进行克隆、序列比对与分析，为进一步研究籽粒早期发育与胚发育机制及基因克隆和功能研究提供参考。
　　主要研究结果如下：
　　1.两个自交系籽粒发育早期共获得63个差异蛋白，通过GO注释分析，这些蛋白共参与15个生物学进程（包括代谢过程23.08％、细胞化过程22.44%、刺激响应14.74%、生物调节6.41%等）、涉及9项功能（包括结合功能42.86%、催化功能40.26%）等、参与9个细胞或细胞器的构成（包括细胞25.16%、细胞部分24.53%、细胞器16.35%和膜9.43%等）。COG功能聚类分析，这些蛋白主要涉及蛋白的翻译后修饰、转换和分子伴侣（33.33%）、能量产生与转换（14.04%）等15类蛋白功能。自交系丹232 D4/D0、D6/D4、D6/D0分别有1个、6个、5个蛋白表达量增加，7个、1个、5个蛋白表达量减少。自交系N04 N4/N0、N6/N4、N6/N0分别有0个、5个、12个蛋白表达量增加，1个、10个、10个蛋白表达量减少。同一时期两个自交系相比，D0/N0、D4/N4、D6/N6中分别有12个、17个、19个蛋白表达量增加，10个、7个、10个蛋白表达量减少。信号转导蛋白、热激蛋白、翻译起始因子、翻译延伸因子、RNA解旋酶等可能在早期发育过程中起着重要的作用。参与碳水化合物代谢的GDP甘露糖-3,5-异构酶、苹果酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶等蛋白在丹232中的表达量始终高于N04，可能涉及籽粒发育的调控。
　　2.两个自交系胚不同发育时期共获得74个差异蛋白，通过GO注释分析，这些蛋白共参与11个生物学进程（包括代谢过程28.26%、刺激响应25.00%、细胞化过程20.65%、多细胞生物过程7.61%等）、涉及7项功能（包括催化功能35.44%、结合功能31.65%、营养储藏22.78%等）、参与了11个细胞或细胞器的构成（包括细胞24.70%、细胞部分24.70%、细胞器21.08%等）。COG功能聚类分析表明，这些蛋白主要涉及蛋白的翻译后修饰、转换和分子伴侣（27.78%）、碳水化合物转运与代谢（25.00%）、能量产生与转换（13.89%）等9类功能。自交系丹232 D33/D20、D46/D33、D46/D20分别有15个、14个、13个蛋白表达量增加，19个、24个、27个蛋白表达量减少。自交系N04两个时期33DAP与20DAP相比，分别有10个蛋白表达量增加，16个蛋白表达量减少。亲环蛋白、乙二醛酶、胚胎发育后期丰富蛋白、热激蛋白等可能在玉米胚发育过程中具有重要作用。
　　3.选取籽粒发育早期与碳水化合物转运与代谢、能量产生与转换、转录等功能相关的5个蛋白，胚不同发育时期，与碳水化合物转运与代谢、胁迫响应等功能相关的4个蛋白，对相关基因的表达进行分析。结果显示，基因在RNA和蛋白水平上的表达趋势多不一致，表明基因转录后修饰对基因表达水平具有很大影响。
　　4.选取功能预测为GDP甘露糖-3,5-异构酶（GME）和磷酸甘油酸变位酶（PGAM）两个差异蛋白，NCBI保守序列比对结果显示，2个蛋白分别属于NADB＿Rossmann超级家族和iPGAM＿N超级家族成员。克隆两个自交系丹232和N04的全长cDNA序列，并对ZmGME和ZmPGAM进行序列分析和比较，两个自交系基因ZmGME存在7个碱基差异，其中两个碱基差异引起编码氨基酸改变；两个自交系基因ZmPGAM存在3个碱基的差异，其中一个碱基差异引起编码氨基酸的改变。这两个基因的功能还有待进一步研究。

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第一章 文献综述

1.1 植物籽粒形成和发育研究进展

1.2 植物蛋白组学研究进展及其在籽粒发育中的应用

1.2.1 非生物胁迫

1.2.2 蛋白翻译后修饰

1.2.3 植物发育进程

1.3 玉米籽粒形成和发育研究进展

1.3.1 玉米籽粒形成与发育研究进展

1.3.2 玉米籽粒形成和发育的蛋白组学研究进展

1.4 研究目的与意义

第二章 不同类型玉米自交系籽粒早期差异蛋白挖掘与分析

2.1 材料与方法

2.1.1 早期籽粒蛋白提取

2.1.2 蛋白质双向电泳

2.1.3 目的蛋白基因表达分析方法

2.1.4 差异蛋白基因的克隆与序列分析

2.2 结果与分析

2.2.1 两个自交系籽粒发育早期形态比较

2.2.2 2-D凝胶图分析

2.2.3 差异蛋白功能分类

2.2.4 同一材料不同时期差异蛋白比较分析

2.2.6 差异蛋白目标基因的荧光定量PCR分析

2.2.7 差异蛋白基因ZmGME的克隆与序列分析

2.3 讨论与结论

2.3.1 玉米籽粒形成差异蛋白的时期和材料特异性

2.3.2 2-DE差异蛋白相关基因的表达

2.3.3 玉米籽粒形成早期关键蛋白及其进一步研究

2.3.4 ZmGME基因的克隆与功能分析

第三章 不同类型玉米籽粒胚发育过程中差异蛋白挖掘与分析

3.1 材料与方法

3.1.1 胚蛋白提取

3.1.2 蛋白质双向电泳

3.1.3 目的蛋白基因表达分析方法

3.1.4 差异蛋白基因的克隆与序列分析

3.2 结果与分析

3.2.1 2-D凝胶图分析

3.2.2 差异蛋白功能分类

3.2.3 同一材料不同时期差异蛋白比较分析

3.2.4 同一时期不同材料间差异蛋白比较分析

3.2.5 差异蛋白目标基因的荧光定量PCR分析

3.2.6 差异蛋白基因ZmPGAM的克隆与序列分析

3.3 讨论与结论

3.3.1 胚发育过程中差异蛋白的时期和材料特异性

3.2.2 2-DE差异蛋白相关基因的表达

3.3.3 胚发育过程中的关键蛋白及其进一步研究

3.3.4 ZmPGAM基因的克隆与功能分析

参考文献

英文摘要