兔胚胎干细胞及分泌液在动物创伤模型上初步应用

摘要

本研究旨在体外分离培养兔胚胎干细胞，初步研究兔胚胎干细胞对软组织创面是否具有促愈作用，为兔胚胎干细胞在创伤修复中的应用提供实验基础;探讨兔胚胎干细胞分泌物在体外对动物机体创面的愈合作用;探讨兔胚胎干细胞分泌物在不同种属之间是否存在特异性以及对待不同的创伤是否有促进愈合的作用，为兔胚胎干细胞培养液在创伤修复中的应用提供实验基础。试验方法、结果和结论如下:
　　1.兔胚胎干细胞的分离、传代
　　选择自然发情母兔与公兔自然交配，配种后90h手术冲胚。对原代培养采取酶消化法，对细胞形态及变化进行观察，取生长良好的兔胚胎干细胞接种在饲养层上，在38℃、5％CO2培养箱中继续培养。
　　2.兔胚胎干细胞培养液的提取
　　当ES细胞传代稳定，开始使用胰酶消化传代法，即:吸去培养液。此时把吸去的培养液收集起来装入到离心管里进行离心:4000rpm*5分钟抽取上清液。将上清液-20℃冻起来
　　3.构建日本大耳白兔组织缺损创面模型
　　4.构建日本大耳白兔眼部组织创伤模型
　　5.构建日本大耳白兔烧伤模型
　　6.构建大鼠软组织缺损创面模型
　　通过实验得到如下结果:
　　1、在日本大耳白兔组织缺损创面模型中，注射兔胚胎干细胞的右侧伤口和没有注射兔胚胎干细胞的左侧伤口比较，右侧的伤口愈合速度要快。注射兔胚胎干细胞的右侧伤口愈合速度和注射兔胚胎干细胞培养液的左侧伤口比较，两者愈合速度没有明显的区别。
　　2、在日本大耳白兔眼部组织创面模型中，滴注兔胚胎干细胞培养液的右侧眼睛和没有滴注兔胚胎干细胞培养液的左侧眼睛比较，右侧眼睛的炎症反应消退的快。
　　3、在日本大耳白兔烧伤模型中，注射兔胚胎干细胞培养液的右侧伤口和没有注射兔胚胎干细胞培养液的左侧相比较，右侧的伤口愈合速度要快。
　　4、在构建大鼠软组织缺损创面中，注射兔胚胎于细胞培养液的右侧伤口和没有注射兔胚胎干细胞培养液的左侧伤口比较，右侧的伤口愈合速度要快且没有出现排斥反应。
　　通过实验得到的结论
　　挑破透明带法和胚胎分割法得到的胚胎容易贴壁和增值，能够分离得到兔类胚胎干细胞;兔胚胎干细胞能够加速创伤的愈合利于动物临床的使用;兔胚胎干细胞培养液易于收集，临床应用便利，其有刺激组织正常细胞的再生，抑制受损细胞的凋亡，利于组织创面的愈合;兔胚胎干细胞培养液不存在种间的差异，不会造成异种动物的排斥，有利于动物临床上创伤的应用。

目录

声明

致谢

论文说明

摘要

1．文献综述

1．1 畸胎瘤千细胞研究概况

1．2 早期胚胎来源的ESCs研究概况

1．2．1 小鼠胚胎干细胞的研究进展

1．2．2 人胚胎干细胞的研究进展

1．2．3 兔胚胎干细胞的研究进展

1．3 胚胎干细胞生物学特性

1．3．1 胚胎干细胞形态和生长特性

1．3．2 胚胎干细胞自我更新能力及全能性

1．3．3 胚胎干细胞表面抗原标志

1．4 胚胎干细胞的治疗

1．5 胚胎干细胞治疗存在的问题

1．5．1 胚胎干细胞分离提纯难度大

1．5．2 胚胎干细胞异常分化

1．5．3 胚胎干细胞本身的遗传不稳定性

1．5．4 胚胎干细胞的免疫排斥

1．6 干细胞培养液的治疗

2．引言

3．材料与方法

3．1 试验材料

3．1．1 试验动物

3．1．2 主要试剂

3．1．3 主要仪器设备

3．1．4 主要溶液的配制

3．1．5 培养液配制

3．2 试验方法

3．2．1 饲养层制备

3．2．2 兔胚胎的获取和培养

3．2．3 内细胞团分离、离散和培养

3．2．4 兔胚胎干细胞分离、传代和冻存

3．2．5 兔类ES细胞培养液的提取

3．3 试验动物与分组

3．3．1 构建日本大耳白兔软组织创伤模型

3．3．2 兔胚胎干细胞培养液静脉注射大白兔血常规的检测

3．3．3 构建日本大耳白兔眼部组织创伤模型

3．3．4 构建日本大耳白兔烧伤模型

3．3．5 构建大鼠皮肤组织缺损创面模型

3．3．6 正常动物背部解剖和组织学结构

4．试验结果

4．1 体外培养兔胚胎干细胞的生长及形态学特征

4．2 注射胚胎干细胞对大白兔创伤的影响

4．3 注射兔胚胎干细胞培养液对大白兔创伤的影响

4．4 在大白兔创伤处注射胚胎干细胞和注射兔胚胎干细胞培养液比较

4．5 静脉注射兔胚胎干细胞培养液观察大耳白兔血常规和温度的变化

4．6 兔胚胎干细胞培养液对眼睛炎症的影响

4．7 注射兔胚胎干细胞培养液对兔烧伤的影响

4．8 注射兔胚胎干细胞培养液对大鼠组织缺损创伤的影响

5．讨论

6．结论

参考文献

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