花生种子不同发育时期的表达谱及DGAT基因的表达分析

摘要

花生是世界范围内广泛种植的重要油料作物之一，中国花生的年产量居世界第一。多年来花生油一直是我国主要的食用植物油之一，花生总产50％以上用来榨油。花生油主要是由油酸和亚油酸等不饱和脂肪酸组成，其含量一般为80％以上，被誉为中国的“橄榄油”。为了在分子水平上揭示控制花生油脂合成的重要基因，本研究以高、低油花生新品系为研究对象，采用高通量测序技术，深入剖析不同花生品种在籽粒不同发育时期的表达谱，分析油脂积累关键时期基因功能和基因结构的差异，发掘与高油形成相关的功能基因。并进一步分析了花生油脂形成的关键基因DGAT及其在种子不同发育阶段的表达。本研究的主要结果如下：
　　1、以花生高、低含油量两个品系为研究对象，成功构建了花生籽仁早期和中后期4个转录组测序文库，利用Solexa高通量测序平台，共获得53924092条Clean reads，总测序长度达4853168280 nt，组装后获得59236条Unigenes序列，总长度为44505000 nt，平均长度为751 nt。
　　2、Unigene的COG功能涉及了大多数的生命活动，整体功能类的基因数量最多，有4730条；核结构相关基因种类的数量最少，只有3条；与油脂转运和代谢类相关的基因有654条；共有15468条 Unigene与数据库的基因具有较高的相似性，且很多的单条 Unigene能够跟多个基因相对应，建立了72383条对应关系，其中代谢过程涉及的基因最多，有6028条。
　　3、以KEGG数据库作为参考，对花生种子油脂合成调控过程中的转录组Unigene进行了详细的注释，并将转录组中的数据按照代谢通路分为126类，有生化代谢通路，植物—真菌互作，植物激素信号传导，苯丙氨酸生物合成，脂类代谢以及RNA降解等。涉及到生化代谢的Unigene数量最多，达到了7672条，占整体的32.95％；其次是植物激素信号传导的基因有1493条，占整体的6.41％；有4大类代谢与油脂相关，分别是脂肪酸代谢途径，涉及的基因有145条；脂肪酸生物合成途径，涉及的基因有85条；不饱和脂肪酸的生物合成，涉及的基因有116条；亚麻酸生化代谢，涉及的基因有138条。
　　4、对两个不同时期的表达谱数据进行整理分析，按照代谢途径对差异表达基因归类，共得到了120多种代谢途径的信息，其中有5种与油脂合成调控联系紧密：一是不饱和脂肪的生物合成；二是亚油酸的新陈代谢；三是亚麻酸的新陈代谢；四是脂肪酸的生物合成；五是脂肪酸的新陈代谢。
　　5、将这些差异表达基因定位到各个代谢途径中，结果表明，所定位的基因表达量大部分是下调的，说明花生种子油脂合成调控初期，各类调控脂肪酸合成的基因比较活跃，而伴随着油脂的合成调控不断继续，相关调节基因表达量下降，各类脂肪酸和油脂的合成也逐渐缓慢。这些数据为克隆花生种子油脂合成调控过程中涉及到的相关基因和研究它们的功能提供了丰富的数据。
　　6、这些差异表达基因很多是脂质代谢过程中具有特异性或具有限速功能的关键基因，其中DGAT是催化三酰甘油（TAG）合成途径最后一步的关键基因，对花生DGAT基因的5条序列进行生物信息学分析表明，5条序列均属于二酰甘油酰基转移酶Ⅰ型（DGAT1)基因。采用实时荧光定量PCR方法对花生DGAT基因在种子不同发育阶段的表达进行分析，结果表明，在高含油量花606和低含油量花12两个花生品种的种子不同发育阶段，二酰甘油酰基转移酶(DGAT)基因的表达量不尽相同，综合实验结果，我们推测AhDGAT基因在花生种子不同发育阶段表达量的差异是影响花生含油量的重要决定因素之一。

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第一章 文献综述

1.1花生概括

1.2花生油脂代谢机制研究

1.3二酰甘油酰基转移酶(DGAT)研究现状

1.4基因组测序现状

1.5 cDNA文库的概述

1.6新一代测序技术

1.6.1测序技术的发展

1.6.2 新一代测序技术应用

1.6.3转录组测序及表达分析

1.6.4数字基因表达谱

1.7本研究的目的和意义

第二章 花生种子不同发育时期的转录组测序及表达谱分析

2.1 材料与方法

2.1.1材料

2.1.2方法

2.2结果与分析

2.2.1提取花生种子总RNA的质量检测分析

2.2.2转录组测序以及产量统计

2.2.3 转录组测序数据的组装和统计

2.2.4 花生种子转录组Unigene功能注释

2.2.5 Unigene的蛋白相邻类的聚类分析

2.2.6 Unigene的基因功能分类分析

2.2.7 Unigene在细胞活动和生物体行为中的解析

2.2.8 花生种子油脂合成初期与高峰期表达谱数据库的比对分析

2.3 讨论

第三章 DGAT基因的序列分析及表达研究

3.1材料与方法

3.1.1材料

3.1.2方法

3.2结果与分析

3.2.1二酰甘油酰基转移酶（DGAT）序列的获得

3.2.2对花生二酰甘油酰基转移酶（DGAT)进行生物信息学分析

3.2.3花生DGAT基因在种子发育过程中的表达分析

3.3讨论

第四章 结论

参考文献

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