普通小麦脂肪氧化酶活性及其基因克隆与功能分析

摘要

面粉色泽是最重要的小麦品质性状之一，对面条、馒头及其它食品品质有重要影响。脂肪氧化酶（Lipoxygenase，简称Lox）是影响面粉色泽的重要因素，现已成为小麦品质育种的重要目标之一。改良 Lox活性有助于改善面制品的色泽、面粉的加工品质以及延长种子的储藏时间等，研究 Lox基因的分子遗传机理对我国小麦品质改良具有重要意义。本研究以咸阳83104/周麦16的110份重组近交系（RIL）和163份黄淮海麦区的主栽品种和高代品系为材料，采用电子克隆技术、分光光度计法、荧光定量PCR、RNA干扰、基因遗传转化、普通 PCR扩增、酶切、分子克隆和 DNA测序等技术以及根据不同基因或等位变异间序列差异开发STS功能标记对参试材料的Lox活性及基因型进行了鉴定，并对163份品种（系）的面粉色泽及部分品质性状进行了测试，主要结果如下：
　　1.黄淮海地区的冬小麦品种（系）籽粒以中等Lox活性为主，不同品种（系）间籽粒Lox活性存在较大差异，变异范围为49.13-110.77 A234 min?1g?1，具有较大的选择潜力。对来自黄淮麦区的163份不同遗传背景的普通小麦冬品种（系）Lox活性在不同环境条件下的方差分析表明，不同年份、不同地点间的Lox活性存在显著性差异，籽粒Lox活性的广义遗传力为0.75，基因型与环境互作效应对Lox活性均有显著影响，而基因型效应对籽粒Lox活性的影响最大。小麦籽粒Lox活性除影响面粉色泽外，对其它品质性状也具有一定影响。Lox活性与面粉白度呈显著负相关，与面粉黄度呈显著正相关，而与蛋白质含量、籽粒硬度、湿面筋含量等品质性状相关但不显著。该研究为进一步了解小麦籽粒 Lox活性与面粉色泽及其它品质性状的关系具有一定的参考价值。
　　2.利用电子克隆技术克隆了普通小麦4BS染色体上的TaLox-B2和 TaLox-B3基因。TaLox-B2基因的gDNA序列全长4267 bp，TaLox-B3基因的gDNA序列全长4246 bp，它们在DNA水平上的相似性达到了84.8％。TaLox-B2和TaLox-B3基因均含有7个外显子和6个内含子，其cDNA全长均为2586 bp，编码一段含有861个氨基酸残基的多肽链。氨基酸序列分析表明，TaLox-B2与TaLox-B3基因的相似性高达97.8%，且预测在170-838处存在一个与蛋白稳定性维持相关的Lox基因家族中较为保守的结构域。
　　3.发现 TaLox-B2基因在我国冬小麦品种中存在有两种等位变异 TaLox-B2a和TaLox-B2b，依据其基因组序列与TaLox-B3基因序列间差异，开发了共显性功能标记Lox-B23。在TaLox-B2a和TaLox-B3类型的材料中分别扩增出788 bp和677 bp片段，与高Lox活性相关，在TaLox-B2b的材料中扩增出660 bp片段，与低Lox活性相关。参试材料中共发现4BS染色体的TaLox-B1、TaLox-B2和 TaLox-B3位点上的5种等位变异组合，其中TaLox-B1a/TaLox-B2a/TaLox-B3a组合类型的Lox活性最高，为75.41 A234 min?1g?1， TaLox-B1a/TaLox-B2b/TaLox-B3b组合类型的Lox活性最低，为72.25 A234 min?1g?1。利用中国春的缺体-四体系将Lox-B23标记也定位于普通小麦4BS染色体上。同时，利用咸阳83104/周麦16和构建的RIL群体进一步明确 TaLox-B3基因与籽粒 Lox活性的关系，结果表明TaLox-B3基因能显著增加小麦籽粒Lox活性。
　　4.对 TaLox-B2与 TaLox-B3基因在小麦不同组织器官、不同逆境条件下以及籽粒发育不同时期的相对表达水平进行RT-PCR分析，结果表明TaLox-B2（TaLox-B2a或TaLox-B2b）和TaLox-B3（TaLox-B3a）基因在普通小麦的根、茎和叶均表达，其中TaLox-B2基因主要在叶中表达，而TaLox-B3基因主要在根中表达。TaLox-B2a和TaLox-B3基因在4℃低温、42℃高温、NaCl胁迫以及PEG6000等逆境条件中表达趋势明显不同，但是它们在叶中的相对表达水平受NaCl胁迫和温度的变化影响较为明显。此外，TaLox-B2a和TaLox-B3基因在小麦开花后7天的籽粒中的相对表达量水平最高，之后均呈下降趋势，但二者的变化趋势存在很大差异，说明不同Lox基因在小麦籽粒发育不同时期的表达趋势明显不同。
　　5.对控制小麦籽粒Lox活性的TaLox-B1基因进行沉默，构建RNAi表达载体并在小麦中进行遗传转化，结果表明基因枪轰击1690个幼胚愈伤组织，最终鉴定得到21棵转基因植株，平均转化率较低，仅为1.2%，且发现转基因植株籽粒Lox活性相比对照株系（野生型）的显著降低，说明TaLox-B1基因的表达产物的缺失导致转基因株系籽粒Lox活性降低。此外，转基因植株幼苗的大小，叶片数以及分蘖数都少于对照株系，说明通过RNAi技术干扰内源TaLox-B1基因不仅导致小麦籽粒Lox活性显著下降，而且促使其农艺性状发生变化。RT-PCR结果表明，转基因小麦植株的TaLox-B1基因的表达水平显著低于对照株系。说明外源基因的导入有效地抑制了脂肪氧化酶基因的表达。

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中文摘要

第一章 文献综述

1 小麦籽粒脂肪氧化酶研究进展

2 脂肪酸氧化酶在其它物种中的研究进展

3 植物RNA干扰研究进展

4 本研究目的和意义

第二章 普通小麦籽粒Lox活性及基因型与环境互作分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第三章 普通小麦4B染色体Lox基因克隆及其与Lox活性的关系

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第四章 TaLox-B1基因表达载体构建及其遗传转化

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第五章 结论

参考文献

附图

附表

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