高通量测序和降解组分析白花泡桐盐胁迫相关microRNAs

摘要

盐胁迫是影响树木生长和木材产量的主要非生物胁迫之一。越来越多的研究表明MicroRNAs(miRNAs)在木本植物的生长发育、新陈代谢和胁迫响应中发挥重要的作用。为了鉴定分析白花泡桐中与盐胁迫相关的miRNAs，本研究构建了二倍体白花泡桐对照组(PF2)和盐处理组(PF2-S4)两个小RNAs文库。采用高通量测序技术总共鉴定出来了33个已知miRNA和80个新miRNA，在这些miRNAs中分别有27个（3个已知miRNA和24个新miRNA）差异显著表达和有45个（13个已知miRNA和32个新miRNA）差异极显著表达。降解组测序在PF2降解组文库中鉴定出来了34个miRNA调控的61个靶基因;在PF2-S4降解组文库中鉴定出来了35个miRNA调控的64个靶基因。随后用GO功能注释对靶基因进行功能分类，其中56个靶基因与分子功能有关，52个靶基因与细胞组成有关，52个靶基因与生物学过程有关。最后采用实时荧光定量PCR验证了6个差异表达的miRNAs和8个靶基因，进一步验证测序的准确性。
　　在本研究中，我们预测到的一些白花泡桐miRNA的靶基因。如pfo-miR5021 a/5021b调控的靶基因与Dof锌指蛋白和F-box蛋白相关;pfo-miR157a/157b调控的靶基因与E3泛素蛋白连接酶RGLG2相关;pfo-mir843调控的靶基因与THO亚族复合体相关;pfo-mir580调控的靶基因与组蛋白H2/H2A相关。这些miRNAs及其靶基因很可能与白花泡桐的抗盐胁迫相关。
　　总之，本研究利用高通量测序技术和降解组鉴定出了盐胁迫下白花泡桐的miRNAs及其靶基因的动态表达模式并对其进行了分析，该结果为理解白花泡桐miRNA在盐胁迫下的作用机制和泡桐的抗盐胁迫分子育种提供理论依据。

目录

声明

致谢

摘要

1 文献综述

1．1 泡桐新品种研究现状

1．1．1 泡桐的用途

1．1．2 泡桐新品种的培育及其特性

1．1．3 四倍体泡桐

1．2 植物对盐胁迫的响应

1．2．1 盐胁迫对植物生长发育的影响

1．2．2 盐胁迫的分子机理

1．2．3 盐胁迫对泡桐生长的影晌

1．3 植物miRNA

1．3．1 miRNA的特征

1．3．2 miRNA的作用机制

1．3．3 miRNA与植物生长发育

1．3．4 生物和非生物胁迫对miRNA的影响

1．3．5 泡桐的miRNAs研究

1．4 miRNA的研究内容

1．4．1 miRNA的鉴定

1．4．2 miRNA靶基因的鉴定

1．4．3 miRNA及其靶基因的验证

1．5 本研究的目的与意义

2 引言

3 材料与方法

3．1 试验材料及盐处理

3．2 主要试剂和仪器设备

3．2．1 主要试剂

3．2．2 主要仪器设备

3．3 总RNA的提取与检测

3．3．1 白花泡桐总RNA的提取

3．3．2 总RNA质量检测

3．4 白花泡桐sRNA文库的构建及测序

3．5 白花泡桐sRNA信息分析

3．6 已知miRNAs的鉴定

3．7 新miRNAs的鉴定

3．8 miRNA的差异表达分析

3．9 降解组测序鉴定miRNA的靶基因

3．10 qRT-PCR验证差异表达miRNAs及其靶基因

4 结果与分析

4．1 小RNA库的构建

4．2 sRNA文库的分类注释

4．2．1 Genbank数据库比对

4．2．2 Rfam数据库比对

4．2．3 sRNA分类注释

4．3 白花泡桐中已知miRNAs的鉴定

4．4 白花泡桐中新miRNAs的鉴定

4．5 PF2和PF2-S4文库中miRNAs的差异表达分析

4．6 降解组测序分析miRNA的靶基因

4．6．1 数据预处理

4．6．2 Rfam检索、Genbank检索和Poly N鉴定

4．6．3 Clean tags分类注释

4．6．4 miRNA降解位点的鉴定

4．6．5 miRNA靶基因的功能注释

4．7 qRT-PCR验证差异表达miRNAs和靶基因

5 结论与讨论

5．1 高通量测序及缺乏白花泡桐基因组信息的局限性

5．2 盐胁迫下差异表达miRNAs的分析

5．3 预测和分析白花泡桐miRNA的靶基因

5．4 主要创新点及展望

参考文献