鸭源鸡杆菌中国分离株F17样菌毛基因的鉴定及其敲除株的构建

摘要

鸭源鸡杆菌(Gallibacterium anatis，G.anatis)是巴氏杆菌科鸡杆菌属的革兰氏阴性菌，主要感染鸡、火鸡、鸭、鹅等禽类。目前越来越多的研究证明，G.anatis作为一种条件性致病菌，不仅是构成鸡上呼吸道和下生殖道正常菌群的一部分，也可引起蛋鸡输卵管炎、腹膜炎等疾病，导致产蛋量下降、死亡率增加等。目前已经确定了G.anatis的数种毒力因子，但其致病机制仍未被阐明。
　　黏附是微生物定殖并侵袭黏膜组织的关键过程。G.anatis作为一种黏膜微生物，已经被证实具有黏附塑料制品、形成生物被膜及产生一种糖蛋白样血凝素等黏附相关功能，但在G.anatis定殖感染自然宿主的过程中发挥关键作用的具体因素还不清楚。在巴氏杆菌科的其他成员中，已经报道了包括菌毛在内的多种黏附素的存在，其中菌毛作为一种毛发样、细长的菌体表面附属结构，是多种细菌的重要毒力因子。
　　鉴于以上背景，本研究对鸭源鸡杆菌中国分离株中F17样菌毛主要类型Flf的分布与表达情况进行了探究，并分析菌毛主要亚单位蛋白FlfA的免疫原性和反应原性。同时，通过鸭源鸡杆菌对鸡输卵管原代上皮细胞的黏附和侵袭特性研究，筛选出致病力相对强的临床分离株作为敲除株构建的野生菌株。最后，尝试对F17样菌毛的flfA基因进行缺失，以期为分析该菌毛在G.anatis感染和致病过程中发挥的作用提供良好的基础材料。本论文详细研究内容如下：
　　1、鸭源鸡杆菌flfA基因的鉴定分析及原核表达
　　参照GenBank中G.anatis UMN179的全基因组序列，针对flfA基因设计1对特异性引物，扩增并克隆flfA全基因片段。结果显示，flfA基因在鸭源鸡杆菌中国分离株中广泛存在。基因序列分析发现，18株G.anatis中国分离株的flfA基因序列同源性为71.1％-100%,与国外参考株的序列同源性为70.2%-99.8%。其推倒的氨基酸序列分析显示，FlfA蛋白具有6-8个优势的抗原表位，并多位于保守序列区。同时，根据对小鼠致病力强的分离株Yu-PDS-RZ-1-SLG的flfA全基因序列设计1对特异性引物，并以其基因组DNA为模板扩增flfA表达片段。将该片段成功克隆到原核表达载体pET-28a，并转化E.coli BL21(DE3)，成功表达FlfA。将上述纯化的重组蛋白免疫家兔，得到兔源FlfA多克隆血清。Western blotting结果表明,FlfA蛋白不仅具有良好的免疫原性和反应原性，而且在不同菌株均能表达，暗示不同毒株的FlfA同系物之间可能存在交叉免疫保护的能力。该试验确定了Flf菌毛类型在鸭源鸡杆菌中国分离株中存在的广泛性，揭示抗原性良好的FlfA蛋白具有作为疫苗候选蛋白的潜能，同时该研究为后续flfA基因缺失突变株的构建提供可靠的免疫学检测方法。
　　2、鸭源鸡杆菌对鸡输卵管原代上皮细胞黏附和侵袭能力的测定
　　本试验采用免疫组织化学染色法检测鸭源鸡杆菌Yu-PDS-Ru-1-SLG株的黏附和侵袭特性，同时利用菌落计数法测定不同鸭源鸡杆菌分离株对鸡原代输卵管上皮细胞黏附能力。免疫组织化学检测结果显示：鸭源鸡杆菌Yu-PDS-Ru-1-SLG感染后0.5、1、1.5、2、3、4h时均未观察到有细菌侵袭细胞的现象，但能导致细胞发生明显的病变，并逐渐破碎脱落；鸭源鸡杆菌Yu-PDS-Ru-1-SLG株对鸡输卵管原代上皮细胞具有一定的黏附能力，并且在一定时间内随着时间的延长黏附于单个细胞的菌量呈现递增趋势。不同菌株黏附试验计数结果显示，不同鸭源鸡杆菌分离株对鸡输卵管原代上皮细胞的黏附能力差异很大。通过免疫组织化学染色法进一步证明Yu-PDS-Ru-1-SLG株不具有侵袭鸡输卵管原代上皮细胞的能力，并且不同鸭源鸡杆菌菌株对鸡输卵管原代上皮细胞黏附能力的差异可能预示其致病力的差异。
　　3、鸭源鸡杆菌flfA基因缺失突变株的筛选
　　本研究根据GenBank中发表的G.anatis UMN179的全基因组序列设计特异性引物，扩增并克隆flfA基因的上、下游同源臂，分别以质粒pBC-SK和自杀性质粒pRE112为骨架，成功构建重组质粒pBC-flfA-Gmr和pREΔflfA。将上述两种重组质粒分别通过自然转化法和接合转移法进行缺失突变株的筛选。用于同源重组的打靶片段和自杀性打靶质粒均能成功转化或转移入相应G.anatis菌株中。在自然转化法中，筛选了大约3000个CFU仍没有得到flfA基因缺失突变株。在接合转移法中，获得flfA基因的单交换菌株，但筛选了大约10000个CFU仍没有得到flfA基因缺失突变株。通过自然转化法构建鸭源鸡杆菌突变株的过程很简便，但对菌株的要求很高，很难筛选出自然感受性高的菌株进行遗传操作。本研究首次在鸭源鸡杆菌基因缺失突变株的构建中使用接合转移法，并取得突破性的进展。目前筛选工作仍在进行。

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中文摘要

文献综述

1 鸭源鸡杆菌概述

2 巴氏杆菌科基因敲除技术的研究进展

3 小结

试验一 鸭源鸡杆菌flfA基因的鉴定分析及原核表达

1材料与方法

2 结 果

3 讨 论

试验二 鸭源鸡杆菌对鸡输卵管原代上皮细胞黏附和侵袭能力的测定

1 材料与方法

2 结果

3 讨 论

试验三 鸭源鸡杆菌flfA基因缺失突变株的筛选

1 材料与方法

2 结果

3 讨 论

全文总结

参考文献

英文摘要

附录