牡丹芍药远缘杂交不亲和性机理及胚胎败育的研究

摘要

远缘杂交育种是牡丹、芍药品种改良和育种的主要方法，而远缘杂交不亲和作为主要因素一直制约其快速发展。在其他植物育种中，中外学者探讨了一些不亲和的机理，但关于牡丹、芍药远缘杂交不亲和机理的研究还很欠缺。在课题组前期研究中，明确了牡丹、芍药远缘杂交不亲和性主要是由受精前障碍造成。本研究拟在前期工作基础上，通过对比亲和授粉与不亲和授粉的花粉管荧光观察结果，基本确定的杂交障碍发生的时间段。进一步结合牡丹、芍药远缘杂交授粉后雌蕊中保护酶系统以及内源激素的动态变化、不亲和应答相关的柱头差异蛋白质组学分析方面深入研究，初步揭示牡丹、芍药杂交不亲和机理，为杂交育种提供理论和技术支撑。同时，通过对受精后杂种败育的胚胎学的观察，为后期胚胎挽救提供技术支持。
　　主要研究结果如下:
　　1.亲和、不亲和授粉后雌蕊柱头上花粉管萌发及花粉管伸长情况的荧光显微对比可以明显看出，在柱头、花柱中都存在抑制花粉管萌发和生长的物质。亲和花粉整齐萌发，花粉管伸长速度先慢后快。不亲和花粉大部分不能水合萌发，少数可以萌发的花粉花粉管伸长速度先快后慢，1h花粉管中就出现胼胝质，3h花粉管开始伸长，12h花粉管扭曲、缠绕、肿胀，24h花粉管停滞在花柱上方，几乎所有花粉管呈变形状态。48h胼胝质已经严重堆积，且大部分的花粉管伸长并无方向性。
　　2.亲和、不亲和授粉后，花粉-柱头相互作用的过程中，授粉引起的过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)活性出现规律性变化，并与荧光显微观察的花粉萌发、花粉管伸长情况基本保持同步。授粉后3h内花粉-柱头识别时期，高活性水平的POD和SOD时，花粉迅速黏附并萌发，而且不亲和花粉在花粉识别阶段POD和SOD活性显著低于亲和花粉。同时，当POD和SOD处于高活性时，花粉管迅速向胚囊伸长，进入胚囊。可见，高活性水平的POD和SOD有利于花粉-柱头识别、黏附和萌发，也有利于受精作用。
　　3.亲和、不亲和授粉后，花柱内源激素也发生规律性变化，并与荧光显微观察的花粉萌发、花粉管伸长情况，以及酶活性变化基本保持同步。授粉后3h内的花粉-柱头识别阶段，亲和雌蕊中的ZR含量迅速升高，而不亲和雌蕊ZR含量急速下降，对应亲和雌蕊上花粉整齐萌发，不亲和雌蕊上几乎不萌发。可见高含量的ZR有利于花粉-柱头识别。在整个受精过程中，当IAA和GA3处于高水平时，都对应了花粉的大量萌发以及花粉管的伸长。且亲和雌蕊柱头上的IAA和GA3的含量都显著高于杂交不亲和授粉的雌蕊柱头。而ABA的含量相对较高时，一定程度的抑制了花粉萌发、花粉管伸长，促进了花粉管的变形扭曲，因此认为ABA可能与不亲和性相关。
　　4.利用iTRAQ技术分析牡丹、芍药远缘杂交亲和、不亲和授粉后雌蕊柱头中蛋白质的差异表达，鉴定到的总蛋白数为2900，其中上调蛋白383个，下调蛋白302个。雌蕊柱头上鉴定到的差异表达的蛋白质主要参与的生化代谢途径和信号转导途径有一般代谢途径、次生代谢产物生物合成途径、核糖体途径、内质网蛋白质加工、糖酵解/糖异生途径等，表明不亲和授粉后的雌蕊柱头内蛋白质代谢和能量代谢较为活跃。其中鉴定到的与不亲和授粉相关代谢通路有RNA降解、钙信号途径、MAPK信号途径、磷脂酰肌醇信号系统。各通路中的差异表达蛋白表明不亲和授粉后，花粉管生长需要的能量合成受阻，花粉管极性生长相关的信号通路和代谢途径受阻。其中烯醇酶(Enolase)、热休克蛋白70 DnaK(HSP70)、钙调蛋白(CALM)下调表达，腺苷酸转运酶ANT上调表达。
　　5.牡丹、芍药远缘杂交授粉后，11d以后陆续开始发现胚胎的降解、细胞壁消失，细胞核与细胞质散乱分布。14d以后幼胚几乎完全降解，到17d,已观察不到胚体了。因此，胚胎挽救可以参考以上败育时期。

目录

声明

致谢

摘要

1．文献综述

1．1 牡丹、芍药远缘杂交育种研究进展

1．2 远缘杂交不亲和性研究进展

1．2．1 远缘杂交不亲和的表现

1．2．2 酶、内源激素对亲和性的影响

1．2．3 不亲和授粉蛋白质组学研究进展

1．2．4 蛋白质组学研究技术进展

2．引言

3．材料与方法

3．1 牡丹、芍药远缘杂交不亲和性

3．1．1 试验材料

3．1．2 试验方法

3．2 牡丹、芍药远缘杂交雌蕊保护酶系统与内源激素对杂交亲和性的影响

3．2．1 试验材料

3．2．2 试验方法

3．4 牡丹、芍药远缘杂交受精后杂种败育胚胎学观察

3．4．1 试验材料

3．4．2 试验方法

4 结果与分析

4．1 牡丹、芍药远缘杂交不亲和性

4．1．1 亲本花粉、柱头电镜扫描

4．1．2 母本柱头可授性

4．1．3 自交、杂交花粉-柱头受精过程观察

4．2 牡丹、芍药远缘杂交雌蕊保护酶系统与内源激素对杂交亲和性的影响

4．2．1 亲和性引起的雌蕊保护酶动态变化

4．2．2 亲和性引起的雌蕊内源激素动态变化

4．3 牡丹、芍药远缘杂交不亲和应答相关的柱头差异蛋白分析

4．3．1 样品重复性CV分析

4．3．2 差异蛋白质表达丰度比(FC)分布

4．3．3 总差异表达蛋白质

4．3．4 总差异蛋白的Pathway富集分析

4．3．5 与牡丹、芍药杂交不亲和柱头应答相关代谢通路及涉及蛋白功能分析

4．4 牡丹、芍药远缘杂交受精后杂种败育胚胎学观察

5．结论与讨论

5．1 牡丹、芍药远缘杂交不亲和性

5．2 牡丹、芍药远缘杂交雌蕊保护酶系统与内源激素对杂交亲和性的影响

5．3 牡丹、芍药远缘杂交不亲和应答相关的柱头差异蛋白分析

5．4 牡丹、芍药远缘杂交受精后杂种败育胚胎学观察

参考文献