水体铜对黄河鲤金属硫蛋白基因的表达影响

摘要

本研究黄河鲤（Cyprinus carpio）为试验对象，在对黄河鲤金属硫蛋白(Metallothionein，MT)基因的克隆及序列分析、黄河鲤MT基因的组织表达分析的基础上通过实时荧光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）监测分析水体铜胁迫下黄河鲤MT基因表达变化规律，以期从分子生物学角度为水体铜污染监测提供新的分子标志物。主要研究结果如下：
　　1、采用RT-PCR方法成功克隆了黄河鲤MT基因的编码区（Coding sequence，CDS）序列，全长183bp，共编码60个氨基酸，不含芳香族氨基酸和组氨酸，其中20个半胱氨酸（Cys）集中分布在肽链的氨基端（N-端）和羧基端（C-端），具有脊椎动物MT典型的Cys-X-Cys、Cys-X-X-Cys、Cys-X-Cys-Cys保守序列结构[1]，预测分子量为6013D，理论等电点为8.38。经核苷酸多序列比对与高身鲫（Carassius cuvieri）同源性最高，为94％，氨基酸序列比对与稀有鮈鲫（Gobiocypris rarus）同源性最高，为95%。黄河鲤MT分子进化亲缘性与其生物学分类地位基本一致。
　　2、依据获取的黄河鲤MT基因片段合成高特异性的引物，采用优化退火温度及构建标准曲线提高引物扩增效率，逐步摸索并成功建立了监测黄河鲤MT基因表达水平的RT-qPCR的程序方法[2]。以β-actin为内参，分析了黄河鲤MT基因的表达具有明显的组织差异性，其中肝胰脏MT表达量最高，其次是肾脏、脑和鳃，肌肉中最少，其中以肌肉组织MT基因的相对表达量为基准单位―1‖，则肝胰脏的MT基因表达量为56，肾脏、脑和腮依次为16.6、7.9和3.4。
　　3、同时用0、0.10、0.30、0.60、1.0、1.5mg/LCu2+体外染毒刺激黄河鲤，采用PCR（RT-qPCR）监测分析不同时间点（6h、12h、24h、48h、96h、192h、12d、16d）肝胰脏、肾脏、腮、肌肉和脑组织金属硫蛋白（MT）基因的表达量。结果表明，铜诱导下黄河鲤MT基因均表达上调且具有明显的组织差异性：不同浓度间存在一定剂量-效应关系，在诱导的前期（0-96h）存在一定的时间-效应[3]；不同组织间MT基因上调量不同，其中肝胰脏最多，其次为肾脏、鳃和脑，肌肉上调最少，在整个诱导期除肝胰脏MT基因表达量不断增加外，其他4个组织MT整体均呈先增高后下降的发展状态，但各个组织的诱导峰值及达到其诱导峰值的诱导时间不尽相同[4]；肝胰脏、肾脏、鳃、脑和肌肉MT的主要诱导集中期分别为：0-48h、0-48h、0-24h、0-48h和0-12h。
　　结果表明，黄河鲤MT基因具有脊椎动物的高度保守序列，重金属铜胁迫下肝胰脏MT基因表达量持续升高，因此可以将黄河鲤肝胰脏MT作为实时监测养殖水环境重金属污染的生物标志物[5]。

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文献综述

1 铜对鱼类的毒理效应

1.1铜污染的来源与危害

1.2铜的毒理学机理

2 金属硫蛋白的研究进展

2.1 金属硫蛋白定义

2.2 金属硫蛋白的理化性质

2.3 金属硫蛋白分类

2.4 金属硫蛋白的结构

2.5 金属硫蛋白的功能

2.6 金属硫蛋白的现实应用

3 重金属对水生动物MT表达影响的研究

3.1 水生动物MT分子生物学研究进展

3.2 水生动物MT分子毒理学

3.3 重金属对水生动物MT的诱导机理

4 研究的目的和意义

试验一 黄河鲤金属硫蛋白基因的克隆及序列分析

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.2 试验方法

2 结果与分析

2.1 总RNA的提取

2.2 MT基因片段的PCR扩增

2.3 MT基因的生物信息学分析

3.讨论

试验二 黄河鲤金属硫蛋白基因的组织表达

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.2 试验方法

2 结果与分析

2.1 总RNA的提取

2.2 两种引物RT-qPCR标准曲线的建立

2.3 黄河鲤MT基因组织表达分析

3讨论

试验三 水体铜暴露对黄河鲤金属硫蛋白基因表达的影响

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.2 试验方法

2 结果与分析

2.1 总RNA的提取

2.2 荧光定量PCR的特异性扩增

2.3 水体铜对黄河鲤MT基因的诱导表达

3讨论

全 文 结 论

参考文献

英文摘要