转移肽大片段缺失的质体型AGPase小亚基在小麦淀粉合成中的功能研究

摘要

淀粉是小麦籽粒重量的决定因素，它的合成是一个复杂的生物学过程，由不同的酶共同催化合成的，其中AGPase是淀粉合成的关键酶。根据在高等植物细胞中的分布，AGPase有两种类型:质体型AGPase和胞质型AGPase。这两种AGPase均是由两个大亚基和两个小亚基组成的异源四聚体。胞质型亚基和质体型亚基均是由核基因编码，而后进入细胞质中合成;但质体型亚基在细胞质中形成的是前体蛋白，需进一步在N端转移肽的引导下，通过质膜进入质体，经过剪切去除转移肽，形成成熟的亚基，才能发挥其相应的功能。在前期研究中，课题组从小麦中分离出一个新的质体型AGPase小亚基基因（TaAGPS1b）(Genbank登录号:EU586278)，它所编码的质体型AGPase小亚基N端转移肽仅有25个氨基酸，比其他作物的质体型小亚基转移肽序列缺失了39个氨基酸（缺失率高达60.9％）。为了研究转移肽大片段的缺失对质体型AGPase的定位及功能的影响，本试验通过亚细胞定位的方法，研究了TaAGPS1b在细胞中的定位;在小麦中遗传转化并获得了TaAGPS1b过表达的转基因小麦植株，发现转基因植株籽粒淀粉含量与粒重均显著提高。主要结果如下:
　　1.克隆转移肽大片段缺失的质体型AGPase小亚基基因的ORF序列，并将其构建到亚细胞定位载体中，通过水稻原生质体转化，以转移肽未缺失的质体型小亚基(TaAGPS1b-FJ643609)为对照，观察了TaAGPS1b-EU586278的亚细胞定位情况。结果发现与对照(TaAGPS1b-FJ643609)定位结果相一致，TaAGPS1b-EU586278蛋白也定位在质体（叶绿体）中。表明质体型AGPase小亚基转移肽部分序列的缺失没有改变转移肽的转运功能，仍能够引导质体型AGPase小亚基的前体蛋白进入质体。
　　2.通过农杆菌侵染法将TaAGPS1b-EU586278的过表达载体导入到小麦中，并通过PCR和Southern blot等方法鉴定出过表达转基因小麦植株。与未经转化的野生型对照植株相比，TaAGPS1b-EU586278过表达转基因小麦植株籽粒内AGPase活性显著提高，成熟籽粒淀粉含量与粒重分别提高了13.1％和9.0％。表明转移肽大片段缺失的质体型AGPase小亚基的催化功能没有受到影响，仍能催化淀粉的合成。

目录

声明

致谢

摘要

1 文献综述

1．1 小麦概述

1．2 淀粉合成

1．2．1 腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶

1．2．2 淀粉合成酶

1．3 转移肽功能

2 引言

3 材料与方法

3．1 试验材料

3．1．1 植物材料、菌种及质粒载体

3．1．2 工具酶、试剂盒及主要试剂

3．1．3 试验所用主要仪器

3．2 试验方法

3．2．1 亚细胞定位

3．2．2 过表达重组载体的构建及小麦的遗传转化

3．2．3 转基因小麦后代的检测筛选

3．2．4 转基因小麦转录水平测定

3．2．5 转基因小麦AGPase活性测定

3．2．6 转基因小麦淀粉含量测定

3．2．7 转基因小麦农艺性状参数的测定

3．2．8 数据分析处理

4 结果与分析

4．1．2 TaAGPS1b-EU586278和TaAGPS1b-FJ643609的克隆

4．1．3 瞬时表达重组载体构建结果

4．1．4 TaAGPS1b-EU586278定位在叶绿体

4．2 转基因小麦后代的获得

4．2．1 转基因小麦植株的PCR筛选

4．2．2 转基因小麦植株的Southern blot验证

4．2．3 转基因小麦植株的TaAGPS1b-EU586278的表达水平

4．3 转基因小麦AGPase活性分析

4．4 淀粉含量及农艺性状分析

5 结论与讨论

5．2 过表达TaAGPS1b提高小麦籽粒AGPase活性及淀粉含量

参考文献

攻读硕士学位期间发表文章及获得荣誉