降解玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素B1菌株的筛选、鉴定及评价

摘要

玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)和黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)，是由真菌产生的具有强烈毒的次级代谢产物。饲料及食品中的真菌毒素污染严重威胁着人类和动物的健康，因此，探求安全、高效、无毒副作用的清除真菌毒素污染的方法成为研究热点。本研究旨在从发霉饲料和草食动物粪便中筛选出高效降解ZEN和AFB的微生物，并探索降解特性、机理以及降解产物的致毒活性。
　　试验一降解ZEN菌株的筛选、鉴定及评价
　　以ZEN为唯一碳源和能源，初筛分离到40株存活菌株，复筛从种兔粪便中筛选到菌株H6，降解率最高，达85.37％。结合形态学、生理生化特性和16S rRNA基因测序分析鉴定菌株H6为解淀粉芽孢杆菌（Bacllus amyloliquefaciens）。菌株H6以6％接种量发酵培养后，其发酵液在37℃、180r/mn、72h时，对1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL和20μg/mL ZEN降解率分别为95.60％，91.38％，93.64％，88.60％和85.80％，其中在12h和24h时，对1μg/mL降解率分别为8669％和89.34％，对20μg/mL的降解率分别为76.67％和84.14％。对于1μg/mL ZEN，在37℃、180r/min、72h时，菌株H6上清液和菌悬液的清除率为6893％和28.70％，而经蛋白酶K、蛋白酶K+SDS和热处理后的上清液几乎无降解活性，80％硫酸铵沉淀的胞外蛋白和聚乙二醇6000浓缩8倍上清的降解率分别为:59.68％和93.80％。ZEN降解产物在MCF-7细胞上的增值率显著降低。LC-MS分析ZEN降解产物分子量为398。以上结果表明从种兔粪便中筛选到的解淀粉芽孢杆菌H6（Bacillus amyloliquefaciens H6）对于1～20μg/mL ZEN均具有较高的降解活性，发挥降解作用的主要是菌株分泌的胞外酶，浓缩上清液具有较好的降解效果，ZEN被降解成分子量为398的无雌激素作用的物质。
　　试验二降解AFB1菌株的筛选、鉴定及评价
　　以香豆素为唯一碳源和能源，初筛分离到42株存活菌株，复筛从羊粪便中筛选到菌株S1，降解活性最高，降解率达61.36％。结合形态学、生理生化特性和16S rRNA基因测序分析鉴定菌株S1为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。菌株S1以10％接种量发酵培养后，其发酵液在37℃、180r/min、48h和72h时，对1μg/mL AFB1的降解率分别为46.21％和80.26％。菌株S1上清液在72h内对AFB1(1μg/mL)的降解率为55.86％，而经蛋白酶K、蛋白酶K+SDS和热处理后的上清液降解活性几乎消失。硫酸铵沉淀的胞外蛋白对AFB1(1μg/mL)的降解率为30.21％～33.13％，而聚乙二醇6000浓缩8倍上清的降解率为85.65％。菌株S1发酵液与AFB1（200μg/mL）在37℃、180r/min条件下共培养72h，AFB1降解率为80.64％。降解后的AFB1在鸡胚肝原代细胞中IL-6、TNF-α和Bax的表达量显著降低(p＜0.05)。以上结果表明从羊粪便中筛选到的枯草芽孢杆菌S1(Bacillus subtilis S1)对于AFB1具有较高的降解活性，主要发挥降解作用的是菌株分泌的胞外酶，浓缩上清液具有较好的降解效果，AFB1降解后对鸡胚肝原代细胞的损伤作用减弱。

目录

声明

致谢

论文说明

摘要

1 文献综述

1．1 玉米赤霉烯酮研究进展

1．1．1 玉米赤霉烯酮的理化性质

1．1．2 玉米赤霉烯酮的毒性

1．1．3 玉米赤霉烯酮的污染现状及限量标准

1．1．4 玉米赤霉烯酮的除去方法

1．1．5 玉米赤霉烯酮的检测方法

1．2 黄曲霉毒素的研究进展

1．2．1 黄曲霉毒素的理化性质

1．2．2 黄曲霉毒素的危害

1．2．3 黄曲霉毒素的污染现状及限量标准

1．2．4 黄曲霉毒素的脱毒方法

2 引言

3 降解玉米赤霉烯酮菌株的筛选、鉴定及评价

3．1 试验材料

3．1．1 主要仪器设备

3．1．2 主要试剂和样品

3．2 试验方法

3．2．3 ZEN含量的检测

3．2．4 菌株的鉴定

3．2．5 不同条件对菌株降解ZEN的影响

3．2．6 筛选出的菌株降解ZEN机理的研究

3．2．7 降解产物毒性及结构分析

3．2．8 数据分析

3．3 结果与分析

3．3．1 菌株的初筛

3．3．2 菌株的复筛

3．3．3 菌种鉴定

3．3．4 不同条件对菌株降解ZEN的影响

3．3．5 菌株降解ZEN机理的研究

3．3．6 ZEN降解产物毒性及结构分析

3．4 讨论

3．5 结论

4 降解黄曲霉毒素B1菌株的筛选、鉴定及评价

4．1 试验材料

4．2．4 菌株的鉴定

4．2．7 AFB1降解产物毒性分析

4．2．8 数据分析

4．3 结果与分析

4．3．1 降解AFB1菌株的筛选

4．3．2 菌种鉴定

4．3．3 不同条件对菌株降解率的影响

4．3．4 菌株降解AFB1的机理

4．3．5 AFB1降解产物的毒性

4．4 讨论

4．5 结论

5 全文结论

参考文献