河南省犊牛腹泻主要病原调查及犊牛腹泻微流控芯片验证

摘要

犊牛腹泻是导致新生犊牛死亡的主要病因之一，也是造成世界范围内养牛业经济损失的原因之一。引起犊牛腹泻的病因有很多，感染性因素被认为是引起腹泻的主要因素。大肠杆菌K99+、轮状病毒A群、冠状病毒、隐孢子虫这四种病原被认为是引起犊牛腹泻的主要病原。近年来国内外学者运用多种方法对犊牛腹泻主要病原分离鉴定，同时积极探索犊牛腹泻快速诊断方法。本研究对河南省犊牛腹泻主要病原进行调查，同时对犊牛腹泻微流控基因芯片进行验证，为本省犊牛腹泻疾病的防控提供科学依据，为犊牛腹泻诊断提供新的技术方法。
　　研究一:犊牛腹泻主要病原PCR鉴定方法的建立。为建立主要病原的PCR鉴定方法，以ELISA方法作为对照。在100份犊牛腹泻样品中，轮状病毒ELISA方法检出率为15％，轮状病毒A群PCR方法检出率为16％。冠状病毒ELISA方法检出率为5％，PCR方法检出率为7％、大肠杆菌K99+ELISA方法检出率为2％，PCR方法检出率为3％。结果显示PCR方法检出率要高于ELISA方法，微小隐孢子虫ELISA方法和PCR方法检出率均为14％，但是PCR方法还鉴定出牛隐孢子虫和瑞氏隐孢子虫。
　　研究二:河南省犊牛腹泻主要病原调查。为调查河南省犊牛腹泻病原情况，使用研究一建立的PCR方法对147份腹泻犊牛和65份无临床症状犊牛粪便样品进行上述四种病原筛查。在147份腹泻样品中隐孢子虫阳性样品44份，检出率为29.93％。轮状病毒A群阳性样品18份，检出率为12.24％。冠状病毒阳性样品7份，检出率为4.76％。大肠杆菌K99+阳性样品3份，检出率为2.04％。在65份无临床症状犊牛粪便样品中共检出隐孢子虫阳性样品12份，检出率为8.16％。轮状病毒A群阳性样品3份，检出率为2.04％。未检出冠状病毒和大肠杆菌K99+。在147头腹泻犊牛59头犊牛为单一病原感染，12头犊牛为两种病原混合感染，1头犊牛为三种病原混合感染，病原检出有地区差异。
　　研究三:犊牛腹泻微流控基因芯片相关指标验证。为了验证犊牛腹泻微流控基因芯片的准确性，使用微流控基因芯片对147份腹泻犊牛粪便样品进行病原筛查，对微流控基因芯片上的隐孢子虫和冠状病毒两个指标进行验证。共检出隐孢子虫阳性样本44份，冠状病毒5份。经过比对两种方法阳性样品检出有较高的一致性。PCR方法和微流控基因芯片方法在对两个病原检出率无显著差异(P＞0.05)。虽然在本试验中样品数量较少，但是通过本次试验的对这两个检测指标验证，表明微流控基因芯片技术在犊牛腹泻病原实验室诊断方面有着一定的应用价值。

目录

声明

致谢

符号说明

摘要

文献综述

1．3 主要致病因素及发病机理

2 犊牛腹泻病料采集与病原诊断技术

2．2 病原诊断技术

3 本研究的目的与意义

3．1 犊牛腹泻主要病原PCR鉴定方法建立

3．2 河南省犊牛腹泻病原流行情况调查

3．3 犊牛腹泻微流控基因芯片部分指标的验证

试验一 犊牛腹泻主要病原PCR鉴定方法的建立

1 试验材料

1．1 试验材料

1．2 试验试剂

1．3 试验仪器

2 犊牛腹泻隐孢子虫巢式PCR鉴定方法建立

2．4 方法

2．6 结果与比较

3 犊牛腹泻轮状病毒A群RT-PCR鉴定方法的建立

3．1 材料

3．2 试剂

3．3 仪器

3．4 方法

3．5 数据分析

3．6 结果与比较

4 犊牛腹泻冠状病毒RT-PCR鉴定方法的建立

4．1 材料

4．2 试剂

4．3 仪器

4．4 方法

4．5 数据分析

4．6 结果与比较

5 犊牛腹泻大肠杆菌K99+PCR鉴定方法的建立

5．1 材料

5．2 试剂

5．3 仪器

5．4 方法

5．5 数据分析

5．6 结果与比较

6 四种病原ELISA方法和PCR方法检测成本、可操作性比较

7 讨论

7．2 四种病原ELISA方法和PCR方法成本、可操作性

试验二 河南省犊牛腹泻主要病原调查

1 试验材料

1．1 试验材料

1．2 试验仪器

1．3 试验试剂

2 试验方法

2．1 样品采集与运输

2．2 样品的保存

3 犊牛腹泻隐孢子虫调查

3．1 粪便样品核酸提取

3．2 隐孢子虫引物的设计与合成

3．3 PCR扩增

3．4 琼脂糖凝胶电泳

3．5 PCR扩增产物的序列测定

3．6 数据分析

3．7 结果及序列分析

4 犊牛腹泻轮状病毒A群调查

4．1 粪便样品病毒RNA提取

4．2 RNA浓度测定

4．3 RT-PCR反应

4．4 轮状病毒A群引物设计与合成

4．9 结果及序列分析

5．1 粪便样品病毒RNA提取

5．2 RNA浓度测定

5．3 RT-PCR反应

5．5 PCR扩增

5．6 琼脂糖凝胶电泳

5．7 PCR扩增产物的序列测定

5．8 数据分析

5．9 结果及序列分析

6 犊牛腹泻大肠杆菌K99+调查

6．7 结果及序列分析

7 结果与分析

7．1 全省犊牛腹泻病原流行情况

7．2 犊牛腹泻病原地区流行情况

8 讨论

9 结论

9．1 河南省犊牛腹泻病原流行情况

9．2 犊牛腹泻病原检测方法

试验三 犊牛腹泻微流控基因芯片部分指标的验证

1 试验材料

1．1 试验样品

1．2 试验仪器

1．3 试验试剂

2．2 芯片加样

2．3 上机检测与结果判读

3 检测结果

4 讨论

5 结论

创新点

参考文献

攻读硕士期间成果汇总

附表