绿盲蝽钠离子通道克隆、序列分析和功能表达

摘要

近年来，由于转BT基因抗虫棉的大量栽种，对农田中棉铃虫、红铃虫等鳞翅目害虫起到明显地控制效果，但也导致了绿盲蝽、红蜘蛛等上升为优势害虫。绿盲蝽Apolygus lucorum(Meyer-dür)属刺吸式口器害虫，由于其在田间可以短距离飞行且个体小，使防治面临着巨大挑战。现在绿盲蝽主要防治手段是化学防治，若长时间这样会带来一系列抗药性问题，使未来防治更加困难。拟除虫菊酯类杀虫剂由于其大量优点，渐渐被用于防治绿盲蝽危害。电压门控钠离子通道是DDT和拟除虫菊酯类杀虫剂的作用靶标，研究昆虫钠离子通道对解决昆虫抗性产生机制上具有重要意义。本研究在绿盲蝽脑部转录组基础上，利用生物信息学分析结合体外功能研究，克隆绿盲蝽钠离子通道基因全长(NCBI序列号:MF627838)，分析全长序列中的选择性剪切及RNA编辑，并在爪蟾卵母细胞表达体系中，通过双电极电压钳技术鉴定了其钠离子通道的功能活性。主要实验结果如下:
　　(1)利用RT-PCR技术克隆出102个绿盲蝽钠离子通道克隆子，其中AlNav1-1开放阅读框长为6015bp，可以编码2005个氨基酸。通过与德国小蠊Blattella germanica钠离子通道（BgNav）、黑腹果蝇Drosophila melanogaster钠离子通道(DmNav)和熊蜂Bombus impatiens钠离子通道(BiNav)多重序列比对发现，AlNav与BgNav氨基酸序列的一致性为82.10％，与DmNavpara氨基酸序列的一致性为75.32％，与BiNav氨基酸序列的一致性为82.11％，再通过与其它54个昆虫钠离子通道系统进化树分析，表明AlNav与其他种昆虫钠离子通道具有较高相似性。经过TMHMM分析，AlNav氨基酸序列包括4个同源结构域Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ，每个结构域分别含有6个跨膜片段S1、S2、S3、S4、S5和S6，AlNav在Ⅰ-Ⅳ结构域S5-S6之间上分别有D、E、K、A四个氨基酸残基，Ⅲ和Ⅳ之间存在MFM。对102个绿盲蝽钠离子通道克隆子测序结果，进行多重序列比对分析，AlNav存在9个选择性剪切位点(j、n、o、a、p、b、s、q、t)，AlNav存在35个RNA编辑，其中18个A至I编辑，11个属于U至C编辑。
　　(2)通过非洲爪蟾卵母细胞表达体系，利用双电极电压钳技术测AlNav功能表达。脉冲激活时，以AlNav和TipE共表达时，产生明显的内向电流。把爪蟾卵母细胞钳置在-120mV，从AlNav1-1稳态激活电压依赖性数据拟合曲线看出，钠通道去极化从-80mV到60mV，阶跃电压5mV，V1/2（半激活电压）是-33.5±1.3mV，K（斜率）是3.1±0.4mV。先给予时间为200ms预前刺激，再给予20ms的-10mV测试刺激，从稳态失活电压依赖性数据拟合曲线看出，刺激从-120mV至40mV，阶跃电压是5mV，V1/2（半失活电压）-47.9±1.9mV，K（斜率）是4.7±0.2mV。功能表达结果表明未注射cRNA的卵母细胞，没有记录到内向电流;仅注射绿盲蝽AlNav，能检测到电流，表达速度较慢;绿盲蝽AlNav和TipE共表达，表达速度迅速。通过检测绿盲蝽钠离子变异体Variants，获得18个具有明显电流的变异体，分别测定钠通道激活电压依赖性、钠通道失活电压依赖性和慢失活电压依赖性，证明了AlNav在非洲爪蟾卵母细胞体系中成功表达。

目录

声明

致谢

摘要

1 文献综述

1．1．2 绿盲蝽发生与危害

1．1．3 绿盲蝽的分布

1．1．4 国内外盲螬的抗性研究

1．1．5 昆虫对拟除虫菊鸶杀虫剂的抗性研究

1．2 电压门控钠离子通道的研究

1．2．1 钠离子通道

1．2．2 脊椎动物钠离子通道

1．2．3 昆虫钠离子通道

1．3 昆虫钠离子通道与抗性的研究

1．3．1 位点突变与抗性

1．3．2 选择性剪切与抗性

1．3．4 钠离子通道与拟除虫菊酯抗性

1．4 爪蟾卵母细胞双电极电压钳技术的研究

1．4．1 爪蟾卵母细胞

1．4．2 双电极电压钳技术

2 引言

3 材料与方法

3．1 绿盲蝽钠离子通道克隆

3．1．1 供试昆虫

3．1．2 供试试剂

3．1．3 仪器和设备

3．1．4 试剂配制

3．1．5 引物设计

3．1．7 反转录合成cDNA

3．1．8 PCR反应、电泳验证及纯化回收

3．1．10 PCR纯化回收产物与载体连接

3．1．11 大肠杆菌DH5α转化

3．1．13 序列测序与分析

3．2．5 体外合成cRNA及纯化回收

3．2．7 cRNA的正微注射

3．2．8 电流记录

3．2．10 数据分析

4．1．1 绿盲蝽钠离子通道全长基因克隆

4．1．2 AlNav同源性和系统发生分析

4．1．3 AlNav结构域预测

4．2 绿盲蝽钠离子通道基因选择性剪切和RNA编辑

4．2．2 AlNavRNA编辑

4．3 绿盲蝽钠离子通道在非洲爪蟾卵母细胞中表达

4．3．2 AlNav和TipE合成cRHA浓度及A200/A200的测定

4．3．3 绿盲蝽钠离子通道在非洲爪蟾卵母细胞中的功能性表达

4．3．4 河豚毒素检测绿盲蝽钠离子通道

4．3．5 绿盲蝽钠离子通道变异体variants门控特征

5 结论与讨论

5．1 绿盲蝽钠离子通道基因全长克隆

5．2 绿盲蝽钠离子通道基因选择性剪切和RSA编辑

5．3 绿盲蝽钠离子通道突变位点及功能表达

参考文献