禽多杀性巴氏杆菌基因组表达文库的构建、免疫检测及ptfa基因的原核表达

摘要

禽多杀性巴氏杆菌病，又称禽出血性败血症或者禽霍乱(fowl cholera)，是由多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida，Pm)引起的一种接触性、败血性传染病，可感染鸡、鸭、鹅、鹌鹑和火鸡等禽类。该病的发病率和死亡率均很高，具有突发性和流行的特点，给养禽业造成巨大的经济损失。该病具发病周期短死亡率高不易治疗特点，被列为重点防治的家禽疫病之一，预防和控制本病的流行已刻不容缓。疫苗接种成为巴氏杆菌病的有效措施，多年来国内外学者一直都很重视对该病预防和控制的研究，研制高效的疫苗已成为研究热点。近年来，所研究的禽多杀性巴氏杆菌抗原，主要有荚膜、菌毛、脂多糖和外膜蛋白，然而每种抗原所提供的保护力是有限的。高效的禽多杀性巴氏杆菌病疫苗应该使疫苗中尽可能多的包含多种特征性重组抗原。本研究构建出禽多杀性巴氏杆菌基因组表达文库，以其免疫小鼠，筛选出具有免疫保护性抗原基因，为新型疫苗的研制奠定基础，并从所获得的具有保护性抗原的基因文库中提取单个片段的基因，对其进行原核表达分析，为进一步开展深入的疫苗研制工作作了铺垫。
　　本研究以禽多杀性巴氏杆菌CVCC474菌株作为研究对象，提取该菌的基因组，采用限制性内切酶Sau3AⅠ进行酶切，将其酶切成500-3000bp的DNA片段，将其插入到真核表载体的BamHⅠ酶切位点，转化人肠杆菌DH5a宿主，构建出5个DNA表达子文库，文库总容量为105个克隆。分别提取5个文库的重组质粒，纯化后将其溶解于PBS缓冲液，获得重组质粒；将105只6周龄纯系雌性小白鼠随机分配为7组，每组15只。1-5组分别为实验组，同时设空载体pcDNA3.1(+)组和PBS对照组。其中1-5组实验组分别免疫接种禽多杀性巴氏杆菌子文库1-5所提取的重组质粒，该重组质粒用灭菌的1×PBS（pH7.2)稀释，其浓度为100μg/μL，pcDNA3.1(+)组接种用用灭菌的1×PBS（pH7.2)稀释，浓度为100μg/μL的质粒pcDNA3.1(+)；PBS组接种1×PBS（pH7.2)。每只小鼠每次免疫剂量为100μL，采取双侧胫前肌注射，自第一次免疫开始每隔2周免疫一次，共免疫3次。然后通过对各免疫组小鼠的血清特异性抗体、细胞免疫应答和相对保护率的检测，来筛选确定免疫效果较好的组，筛选含有保护性抗原基因的子文库，结果筛选出基因组表达子文库1为免疫效果较好的文库，证明文库中含有保护性基因，为进一步筛选保护性抗原基因打下基础，有助于从分子水平上认识禽多杀性巴氏杆菌和寻找禽霍乱病的新的基因。同时研制出预防禽多杀性巴氏杆菌病的廉价、高效疫苗打下基础。然后从文库1中随机挑选一个重组质粒，进行质粒酶切鉴定，序列测定，结果表明该基因为已知的菌毛基因ptfa，随后构建该基因的原核表达载体进行诱导表达，为相应基因工程亚单位疫苗的研制奠定基础。

目录

第1章 绪论

1.1禽巴氏杆菌病概述

1.2 Apm重要免疫原的研究进展

1.3 禽巴氏杆菌病疫苗研究进展

1.4基因组表达文库研究进展

1.5基因组表达文库构建及免疫研究进展

1.6本实验的研究意义及主要内容

第2章 Apm基因组表达文库的构建

2.1实验材料

2.2试验方法

2.3结果与分析

2.4讨论

第3章 Apm基因组表达文库的免疫检测

3.1试验材料

3.2 试验方法

3.3结果和分析

3.4讨论

第4章 Apm的ptfa基因原核表达

4.1试验材料

4.2试验方法

4.3结果和分析

4.4讨论

第5章 结论

5.1 Apm文库的构建和免疫检测

5.2 ptfa基因的原核表达

参考文献

缩略语词汇表

致谢

攻读硕士学位期间研究成果