产耐热α-葡萄糖苷酶重组大肠杆菌的构建及发酵条件优化研究

摘要

α-葡萄糖苷酶广泛存在于自然界生物体内，种类繁多，性质各异。它是一种限制性水解酶，可从低聚糖类底物的非还原末端切开α-1,4糖苷键，释放出葡萄糖，或将游离出的葡萄糖残基转移到另一糖类底物形成α-1，6糖苷键，从而得到非发酵性的低聚异麦芽糖或糖脂、糖肽等。
　　 Α-葡萄糖苷酶应用于生产低聚异麦芽糖，受到食品工业界的重视。但生产过程中的环境条件对酶活影响很大，因此耐热α-葡萄糖苷酶成为研究的热点之一。
　　 本实验以非解朊栖热菌HG102 α-葡萄糖苷酶基因为模板进行PCR扩增α-葡萄糖苷酶基因，与表达载体pET28α(+)连接，转入感受态细胞DH5α，筛选阳性重组体，酶切检验，然后把构建好的重组质粒转入BL21(DE3)，经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达。诱导后进行细胞超声破碎，蛋白加热沉淀和SDS-PAGE电泳分析。
　　 结果表明，PCR扩增得到1 900 bp左右的DNA片段，重组基因诱导表达后检测得α-葡萄糖苷酶酶活，蛋白经电泳分析显示其相对分子质量约为65 KD，与理论值相符。经测序，克隆的基因序列与文献一致。
　　 对取得的α-葡萄糖苷酶进行了酶学性质的初步研究，α-葡萄糖苷酶的最适pH为7.0，且在pH5.0-8.0条件下具有较好的稳定性。Α-葡萄糖苷酶的最适温度为85 ℃，在85 ℃条件下热处理3 h后，α-葡萄糖苷酶的活性约为初始值的60％，具有较好的热稳定性。
　　 对重组菌进行了碳源、接种量、金属离子、IPTG添加时间、诱导时间单因素培养条件优化，优化结果：在LB液体培养基中添加1％甘油和0.01％的Mn2＋，接种量为6％，发酵培养2 h时，添加IPTG至终浓度为 1.2 mmol/L，诱导表达16 h，得到的α-葡萄糖苷酶酶活最高，最终酶活由初始的4.25 U/mL 提高到40.85 U/mL，提高了8.6倍。
　　 根据单因素优化实验结果，以α-葡萄糖苷酶酶活为指标，选取接种量、诱导剂添加时间及诱导培养时间为考察因素，设计三因素三水平的正交实验。三个因素对发酵影响的主次顺序为：诱导剂添加时间>接种量>诱导培养时间。其最佳工艺条件为接种量8％，诱导剂IPTG添加时间2 h，诱导培养时间20 h。对重组菌发酵条件进行正交优化实验后，最终酶活提高到63.53 U/mL。

目录

文摘

英文文摘

声明

1 绪论

2 材料与方法

3 重组大肠杆菌的构建

4 重组菌产酶条件的的研究

5 结论与展望

参考文献

致 谢

攻读学位期间发表的学术论文