阳离子影响乙烯和生长素相互作用机制

摘要

植物生存需要众多营养元素，包括Cu、Zn、Mo、H、Mn等一些金属离子。但过量离子对植物造成毒害。植物主要依靠“阳离子/H+”转换器排出体内多余离子，维持细胞离子恒稳态。H+—ATP水解酶水解提供能量驱动“阳离子/H+”转换器，因而H+—ATP酶活性对维持植株细胞内离子平衡具有重要意义。
　　 植物激素生长素(Auxin)和乙烯(Ethylene)参与响应多种逆境环境。外源离子能够影响二者之间的相互作用，但其机制尚需很多工作。本文利用对乙烯不敏感的生长素运输因子突变体、对NaCl敏感的乙烯合成因子突变体及它们的双突变体为材料，通过RT—PCR、遗传杂交、转基因、酵母双杂交、BIFC等研究技术，初步研究了过量阳离子对生长素和乙烯相互关系的影响机制。
　　 本实验从拟南芥生物资源中心(Arabidopsis Biological Resource Center，ABRC)购买有关生长素运输因子的T-DNA插入突变体株系，鉴定后得到纯合体植株Atane(Arabidopsis thaliana Auxin transport mutant not sensitive to ethylene)；同时购买了乙烯合成相关因子的T—DNA插入突变体株系进行纯合体鉴定，鉴定后得到纯合体植株Atern(Arabidopsis thaliana gene for Ethylene response to NaCl);利用遗传学杂交技术，得到双突变植株Atane/Atern。
　　 加拿大拟南芥资源网站(http://www.bar.utoronto.ca)基因芯片结果显示，NaCl处理显著改变AtANE和AtERN表达量。与此结果一致的RT—PCR结果显示：150 mM NaCl处理后AtANE表达量下降，而AtERN表达量则有所上升，表明NaCl在转录水平上诱导AtERN表达量升高、AtANE表达量降低；在65 mM CaCl2处理下，AtANE和AtERN表达量均有明显下降，表明NaCl和CaCl2在转录水平上调节AtANE和AtERN表达。
　　 构建AtANE：：GUS和AtERN：：GUS植株，染色实验发现AtANE和AtERN表达非常高，且从幼苗至成苗的各个部位都有明显表达。AtANE在未处理情况下几乎分布于整个植株，AtERN表达也非常明显。但在65 mM CaCl2处理下，染色AtANE和AtERN表达都明显下降；150 mM NaCl处理抑制AtANE表达，但增加AtERN表达。这些染色结果与RT—PCR结果一致。
　　 在150 mM NaCl处理下，Atane和Atern萌发及根伸长受到明显抑制，证明Na+影响Atane和Atern植株幼苗的生长发育。65 mM CaCl2在一定程度上抑制了Atane和Atern萌发及植株幼苗萌发，但与野生型相比差异并不显著，说明了Ca2+对Atane和Atern植株幼苗萌发及根生长发育影响较小。
　　 H+—ATPase酶活性对植物体维持胞内离子平衡很重要。测定其酶活性结果显示，分别使用150 mM NaCl和65 mM CaCl2处理时，该酶活性在Atane和Atern中都有明显的增加：150 mM NaCl处理时，Atane中H+—ATP酶活性增加22．9％，Atern中H+—ATP酶活性增加32．9％；65 mM CaCl2处理时Atane中H+—ATP酶活性增加38．5％，Atern中H+—ATP酶活性增加116％。利用pH探针进一步测定植物体内H+浓度变化，结果显示：150 mM NaCl和65 mM CaCl2处理时Atane和Atern中H+浓度都有所升高。推测AtANE、AtERN通过提高H+—ATP酶活性来排除细胞内多余的离子，维持细胞内离子平衡，提高植株对阳离子的适应能力。
　　 为了探究AtANE和AtERN之间的相互关系，酵母双杂交实验结果显示PACT—AtERN/PAS2—AtANE酵母菌落显示蓝色；双分子荧光互补实验结果在野生型拟南芥叶肉细胞原生质体内，能检测到发生相互作用的黄色荧光信号。这些结果说明AtANE和AtERN在蛋白水平上存在一定的相互作用。使用乙烯抑制剂AgNO3及生长素抑制剂NPA处理突变体，Ag+对Atane单突变体植株的萌发及根长抑制程度要明显高于其他3种植株。推测乙烯的正常合成影响AtANE表达。
　　 综上所述，AtANE和AtERN具有一定相互作用关系，且推测AtANE表达有赖于乙烯的正常合成。AtANE和AtERN参与了植株应对Na+、Ca2+的响应过程。Na+和CA2+参与了AtANE和AtERN植株相互作用调节，并通过提高H+-ATP酶活性来排出细胞内多余的离子，维持植物体内离子稳态。

目录

文摘

英文文摘

缩写词

1 前言

1.1 离子胁迫的影响

1.1.1 Na+对植物的影响

1.1.2 Ca2+对植物的影响

1.2 阳离子/H+反向转运蛋白

1.3 生长素在植物中的研究进展

1.3.1 生长素的合成与运输

1.3.2 生长素抑制剂NPA对植物影响

1.4 乙烯响应离子胁迫应答机制

1.4.1 乙烯合成与信号转导

1.4.2 乙烯抑制剂AgNO3对植物的影响

1.5 生长素和乙烯相互作用关系

1.6 立题依据

2 材料和方法

2.1 验材料料

2.2 实验试剂

2.3 实验溶液

2.3.1 常用溶液

2.3.2 GUS染色溶液

2.3.3 H+-ATP酶活性测定溶液

2.3.4 酵母双杂交所用试剂

2.3.5 酵母转化所用缓冲液

2.3.6 游离原生质体所用溶液

2.3.6 原生质体转化所用溶液

2.3.7 GUS染料配制

2.4 实验所用引物

2.4.1 纯合体鉴定所用引物

2.4.2 RT-PCR鉴定基因表达所用引物

2.4.3 BIFC载体所用引物

2.5 实验方法

2.5.1 拟南芥的种植

2.5.2 杂交实验

2.5.3 拟南芥幼苗萌发统计

2.5.4 拟南芥幼苗根伸长测量

2.5.5 T-DNA插入纯合体筛选方法

2.5.6 拟南芥基因组DNA的提取

2.5.7 拟南芥总RNA的提取

2.5.8 大肠杆菌感受态细胞的制备

2.5.9 质粒DNA的提取

2.5.10基因扩增与重组质粒载体的构建

2.5.11重组质粒的鉴定

2.5.12 H+-ATP酶活性的测定方法

2.5.13激光共聚焦扫描技术记录H+浓度变化

2.5.14 GUS染色

2.5.15酵母双杂交实验

2.5.16拟南芥原生质体的分离

2.5.17 PEG转化

3 结果与分析

3.1 T-DNA插入纯合突变体的鉴定

3.2 双突变植株的筛选

3.3 AtANE及AtERN表达量的分析

3.4 AtERN与AtANE相互关系分析

3.4.1 AtERN与AtANE体外互作关系

3.4.2 AtERN与AtANE体内互作关系

3.5 Na+对突变体表型的影响

3.5.1 Na+对突变体萌发率的影响

3.5.2 Na+对突变体根伸长的影响

3.6 Ca2+对突变体表型的影响

3.6.1 Ca2+对突变体萌发率的影响

3.6.2 Ca2+对突变体根伸长的影响

3.7 Ag+对突变体表型的影响

3.7.1 Ag+对突变体萌发率的影响

3.7.2 Ag+对突变体根长的影响

3.8 NPA对突变体表型的影响

3.8.1 NPA对突变体根长的影响

3.8.2 NPA对突变体萌发率的影响

3.9 GUS染色观察突变体表达量的差异

3.10 AtANE及AtERN对细胞内离子平衡的影响

3.10.1离子处理下植株H+-ATP酶活性的变化

3.10.2离子处理下植株H+浓度的变化

4 讨论

4.1 AtANE参与植株应对阳离子

4.2 AtERN参与植株应对阳离子

4.3 生长素与乙烯相互关系

5 结论

参考文献

致谢