基于UPLC/Q-TOF-MS的慢性睡眠剥夺大鼠脑脊液代谢组学研究

摘要

目的:
　　基于UPLC/Q-TOF-MS，探讨慢性睡眠剥夺不同时间对大鼠脑脊液中内源性代谢产物的变化并寻找睡眠因子。
　　方法:
　　1.慢性睡眠剥夺大鼠模型的复制
　　取实验动物SD雄性大鼠48只，在实验条件下饲养一周，以适应环境，期间自由饮水和获取食物。一周后将大鼠随机分为6组，分批次置于睡眠剥夺仪，每次8只，分别进行睡眠剥夺1、3、5、7、9天，期间自由饮水和获取食物，睡眠剥夺仪速度设置为5m/分钟，运动5秒，暂停5秒。空白对照组的实验动物在睡眠剥夺仪上饲养，速度设置为0m/分钟，自由饮水和获取食物。
　　2.基于UPLC/Q-TOF-MS的慢性睡眠剥夺大鼠脑脊液代谢组学的研究
　　于慢性睡眠剥夺后，为避免睡眠剥夺的消退，立即腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，用脑立体定位仪固定，头部剪毛，消毒，并于腹下垫恒温垫。参考大鼠脑立体定位图谱，以枕骨嵴下3毫米处的肌肉间隙处为进针点。进针角度与身体平行，针坡面向上缓慢向前进针到小脑延髓池，深度约为0.5厘米。缓慢抽取约80微升脑脊液，后迅速退针，将脑脊液移入EP管中，放入液氮中速冻后移入-80℃中保存。待所有样品采集完毕，集中将脑脊液进行处理，利用UPLC/Q-TOF-MS进行分析。筛选出内源性代谢产物并探究其变化趋势。
　　结果:
　　1.慢性睡眠剥夺大鼠模型的复制
　　本课题睡眠剥夺的原理是利用实验动物所站立的平台的随机移动而使实验动物无法进入睡眠，减少了水环境睡眠剥夺或电刺激睡眠剥夺给实验动物造成的伤害。运行和休息时间可以循环进行，达到了慢性睡眠剥夺的目的，很好地模拟了人的睡眠不足状态，成功地完成了慢性睡眠剥夺动物模型的复制。
　　2.基于UPLC/Q-TOF-MS的慢性睡眠剥夺大鼠脑脊液代谢组学的研究
　　2.1正离子模式下，基于UPLC/Q-TOF-MS的慢性睡眠剥夺大鼠脑脊液代谢组学的研究
　　根据PLS-DA得分图呈现出的分组趋势如下:空白组和慢性睡眠剥夺1天的样品集中在第四象限，慢性睡眠剥夺3天、5天、7天的样品集中在第一象限，慢性睡眠剥夺9天的样品离散在第一象限与其他各组在主成分1上存在明显差异。经过交叉验证，在经过标签打乱后累积R2Y由0.77下降到0.51，累积Q2由0.56下降到-0.14，模型不存在过拟合现象，模型中分组信息可信，有必要进一步对差异性代谢产物进行分析。
　　筛选出的内源性代谢产物有:组氨半胱氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-色氨酸、辛酰左旋肉碱、L-谷氨酰胺、左旋肉碱、乙酰左旋肉碱、戊酰基左旋肉碱、己左旋肉碱等25种。
　　正离子模式下，大鼠脑脊液中L-蛋氨酸、癸左旋肉碱和L-色氨酸的含量总体呈先升高后降低的趋势。
　　正离子模式下，大鼠脑脊液中的L-组氨酸、L-谷氨酰胺、丁酰左旋肉碱、十四烷左旋肉碱与磷脂(O-16∶0/0∶0)的含量总体呈升高趋势。
　　正离子模式下，大鼠脑脊液中的1-亚油酰甘油磷酸胆碱与戊二酰左旋肉碱的含量变化无显著性趋势，基本保持平稳。
　　正离子模式下，大鼠脑脊液中的己烯-左旋肉碱、甲基戊二左旋肉碱、十六烷左旋肉碱、溶血磷脂(16∶0)和溶血磷脂(18∶1)的含量基本呈先降低再升高的趋势。
　　正离子模式下，大鼠脑脊液中的辛酰左旋肉碱和戊酰基左旋肉碱的含量变化相对平稳，只有第3天左右显著升高，并有显著性差异。
　　正离子模式下，大鼠脑脊液中的左旋肉碱、乙酰左旋肉碱、十一烷左旋肉碱和溶血磷脂(18∶0)的含量变化整体呈先升高再降低而后升高的趋势。
　　正离子模式下，大鼠脑脊液中组氨半胱氨酸和L-赖氨酸的含量在睡眠剥夺的前5天均无显著性变化，组氨半胱氨酸在第7天显著降低并在之后快速升高，L-赖氨酸在第7天左右迅速降低。
　　正离子模式下，大鼠脑脊液中的己左旋肉碱的含量变化趋势幅度较大，在第1天至第7天急速上升，并在第7天至第9天保持稳定。
　　正离子模式下，大鼠脑脊液中的硬脂酰左旋肉碱的含量变化呈下降趋势，在第3天左右有短暂的小幅度升高。
　　在正离子模式下筛选出的25个离子中，L-色氨酸、L-组氨酸和组氨半胱氨酸与睡眠有关。
　　在有关睡眠的代谢产物中，大鼠脑内组氨半胱氨酸的含量虽有波动但始终上升，猜测其为睡眠因子，组氨半胱氨酸与睡眠的关系，需要通过药效学试验，进一步研究证实。
　　2.2负离子模式下，基于UPLC/Q-TOF-MS的慢性睡眠剥夺大鼠脑脊液代谢组学的研究
　　根据PLS-DA得分图呈现出的分组趋势如下:空白组和慢性睡眠剥夺1天的样品、慢性睡眠剥夺3天和5天的样品与慢性睡眠剥夺7天和9天样品离散开。经过交叉验证，在经过标签打乱后累积R2y由0.74下降到0.58，累积Q2由0.41下降到-0.034，模型不存在过拟合现象，模型中分组信息可信，有必要进一步对差异性代谢产物进行分析。
　　筛选出的内源性代谢产物有:柠檬酸、d半乳糖、L-天冬氨酸、L-谷氨酸盐、L-丝氨酸、L-酪氨酸、琥珀酸、(R)-3-羟基-十六烷酸、磷脂(O-16∶0/2∶0)。
　　负离子模式下，大鼠脑脊液中的d半乳糖、L-天冬氨酸和L-谷氨酸盐的含量变化趋势大体均呈先降低，而后升高，再下降的趋势。
　　负离子模式下，大鼠脑脊液中的L-丝氨酸、柠檬酸、琥珀酸和磷脂(O-16∶0/2∶0)的含量先升高再降低，在第7天左右最大，而后急速降低。
　　负离子模式下，大鼠脑脊液中的L-酪氨酸的含量整体呈下降趋势，差异显著。
　　负离子模式下，大鼠脑脊液中的(R)-3-羟基-十六烷酸的含量变化相对平稳，只有第5天左右显著升高。
　　在负离子模式下筛选出的9个离子中，L-天冬氨酸、L-谷氨酸盐、L-丝氨酸、L-酪氨酸与睡眠有关。
　　在有关睡眠的代谢产物中，大鼠脑内的L-丝氨酸的含量在睡眠剥夺的前7天始终上升，猜测其为睡眠因子，L-丝氨酸与睡眠的关系，需要通过药效学试验，进一步研究证实。
　　结论:
　　1.慢性睡眠剥夺会使大鼠脑脊液中的多种内源性代谢产物发生一定变化，且变化趋势不一致。
　　2.通过UPLC/Q-TOF-MS检测技术，在正离子模式下，在大鼠脑脊液中检测到25个内源性代谢产物，在负离子模式下，检测到9个内源性代谢产物。
　　3.这些代谢产物中，组氨半胱氨酸、L-组氨酸、L-色氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸盐、L-丝氨酸和L-酪氨酸与睡眠有关，其中L-组氨酸和L-丝氨酸随着睡眠剥夺的进行含量升高，猜测其为睡眠因子。

目录

缩略语表

摘要

前言

文献综述

1．睡眠与睡眠不足

1．1 睡眠的生理功能

1．2 睡眠不足的危害

2．睡眠“负债”补偿机制

2．1 睡眠“负债”的概念

2．2 睡眠“负债”的补偿机制

3．促睡眠因子的研究

3．1 促睡眠因子的概念

3．2 促睡眠因子的发现与研究进展

4．慢性睡眠剥夺动物模型的复制

4．1 水平台睡眠剥夺

4．2 电刺激睡眠剥夺

4．3 跑步机法睡眠剥夺

5．脑脊液的研究进展

5．1 脑脊液的产生与循环

5．2 脑脊液的生理功能

6．代谢组学及其研究进展

6．1 代谢组学的基本概述

6．2 代谢组学的分析技术

6．3 代谢组学的数据分析

7．课题研究思路与技术路线

7．1 课题研究思路

7．2 课题技术路线

实验部分

第一部分 慢性睡眠剥夺大鼠模型的复制

1．实验材料

2．实验条件

3．实验方法

4．实验结果

第二部分 基于UPLC／Q-TOF-MS的慢性睡眠剥夺大鼠脑脊液代谢组学的研究

1．实验材料

2．实验环境

3．实验方法

4．实验结果

讨论

结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的论文

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个人简历

创新点说明