产氨基酰化酶米曲霉的诱变育种及其发酵条件优化

摘要

氨基酰化酶是一种能专一性水解DL-氨基酸的胞外酶，可将DL-氨基酸拆分获得D-氨基酸和L-氨基酸，因而在食品、医学等领域有着重要应用。
　　本论文采用实验室保藏的米曲霉A0菌株作为出发菌株，将其制备成原生质体后进行紫外-氯化锂诱变，最终筛选出一株氨基酰化酶产量高且遗传稳定性好的诱变株A15。确定了该菌株制备原生质体的最佳条件:菌龄为30h，复合酶配比为1.5％蜗牛酶，1％溶菌酶，1.5％纤维素酶，酶解反应温度为28℃，酶解反应时间为3h，0.8 mol/L NaCL渗透压稳定剂。在此条件下，米曲霉A0菌株的原生质体形成率和再生率都较为理想。确定了紫外-氯化锂诱变的最佳条件:诱变时间为80 s，诱变强度为15 cm，氯化锂浓度为0.9％。在功率为15W的紫外灯的照射下，按以上条件进行诱变处理。经过初筛选出15株变色圈直径与菌落直径比值大于出发菌株的诱变株，再经过复筛测定酶活力，筛选出5株酶活力明显比出发菌体提高的菌株，其中突变株A15的酶活力比出发菌株A0的酶活力提高了95.4％，高达589.7 U/g。
　　研究了碳源、氮源、碳氮比、料水比、接种量、表面活性剂、无机盐、初始pH及培养温度等单因素对高产氨基酰化酶菌株的影响，由实验结果可知:最佳碳源是麦麸，最佳氮源是豆粕，最佳碳氮比是8∶2，最佳料水比是1∶1，最佳接种量是8％，最佳表面活性剂是0.1％的吐温-80，最佳无机盐是MgSO4，最适初始pH是7.0，最适培养温度是30℃。
　　根据单因素试验结果，进行PB实验及BBD实验，找出了高产氨基酰化酶的最主要的三个因素，分别为麦麸、豆粕和料水比。综合单因素试验结果，优化了产酶培养基的组成和培养条件，如下:250 mL摇瓶装麦麸8.12g，豆粕2.06 g，料水比1.05，0.2％（质量分数）MgSO4，添加1％（质量分数）的吐温-80，初始pH7.0，培养温度30℃，接种量8％。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 米曲霉

1．1．1 米曲霉菌种选育的发展趋势

1．1．2 米曲霉的应用

1．2 氨基酰化酶

1．2．1 氨基酰化酶的分类

1．2．2 氨基酰化酶的来源

1．2．3 氨基酰化酶的应用

1．2．4 氨基酰化酶的研究现状

1．3 原生质体诱变育种

1．3．1 原生质体诱变的意义

1．3．2 制备原生质体的来源

1．4 立题依据

1．5 本课题的研究内容

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 菌种

2．1．2 培养基

2．1．3 主要试剂

2．1．4 主要仪器

2．2 实验方法

2．2．1 培养方法

2．2．2 分析方法

2．2．3 米曲霉原生质体的制备与再生

2．2．4 米曲霉原生质体诱变育种

2．2．5 遗传稳定性试验

2．2．6 高产氨基酰化酶米曲霉培养条件的优化

3 结果与讨论

3．1 米曲霉原生质体的制备与再生结果

3．1．1 不同菌龄对原生质体形成和再生的影响

3．1．2 酶解温度对原生质体形成和再生的影响

3．1．3 酶解时间对原生质体形成和再生的影响

3．1．4 不同渗透压稳定剂对原生质体形成和再生的影响

3．1．5 酶解液的不同复合酶配比对原生质体形成和再生的影响

3．1．6 小结

3．2 米曲霉高产氨基酰化酶菌株的原生质体诱变育种

3．2．1 紫外线-氯化锂诱变

3．2．2 传代培养

3．2．3 小结

3．3 高产氨基酰化酶菌株米曲霉培养条件的优化

3．3．1 高产氨基酰化酶菌株米曲霉培养条件的单因素优化

3．3．2 响应面法优化培养条件

3．4 小结

4 结论

5 展望

参考文献

致谢