拟南芥ABC转运蛋白P2SA1在下胚轴向光弯曲中的功能分析

摘要

植物向光性可保证其以最佳取向获得光源，其中蓝光受体向光素(PHOT1/PHOT2)在植物向光性中起重要作用，但其信号转导的机制研究以及新信号组分的确定仍亟待突破。PHOT1可调节较宽范围蓝光引起的拟南芥下胚轴向光弯曲，而PHOT2仅介导强蓝光诱导的下胚轴向光弯曲。该现象既体现PHOT1和PHOT2功能冗余性又表现其作用的特异性。虽已证明向光素PHOT1可能通过桥联蛋白NPH3、RPT2和PKS1相互作用，调节生长素输出输入载体如PIN1和AUX1的活性及再定位，然而具体作用机制并不清楚。遗传分析显示NPH3和RPT2单基因突变均可导致拟南芥缺失蓝光诱导的下胚轴向光弯曲，暗示NPH3和RPT2参与调节PHOT1和PHOT2介导的下胚轴向光弯曲，然而RPT2仅与PHOT1相互作用，并不与PHOT2互作。PHOT2互作蛋白RCN1的发现有望揭开PHOT2调节下胚轴向光弯曲的可能作用机制，然而RCN1负调节PHOT2介导的向光弯曲，且不与PHOT1互作。ABCB19（生长素外流载体）基因的发现，可能搭起向光素与生长素之间的桥梁，遗憾的是该蛋白作为向光素的作用底物仅受PHOT1调节，不能解释PHOT2调节下胚轴向光弯曲的机制。
　　PHOT1和PHOT2对拟南芥下胚轴向光弯曲调节的功能冗余，限制了人们对PHOT2的研究。为此，我们以拟南芥phot1突变体为材料，通过EMS诱变筛选PHOT2下游信号调节子从而避开PHOT1基因的干扰。目前，成功筛选并克隆到2个基因，分别命名为P2SA1和P2SA2((P)hototropin(2)(S)ignaling(A)ssociated)。P2SA1基因编码一个ABC家族蛋白，P2SA2被证明是NPH3(Nonphototropic hypocotyl3)的等位基因。亚细胞定位显示，P2SA1和P2SA2均定位于细胞质膜。P2SA1和P2SA2基因的突变，均可导致拟南芥缺失强蓝光诱导的下胚轴向光弯曲反应，类似于 phot1phot2双突变表型。与P2SA2基因功能不同的是，P2SA1基因的突变并不影响弱蓝光诱导的拟南芥下胚轴向光弯曲。构建P2SA1和P2SA2基因的功能回补载体和超表达载体获得p2sa1 pP2SA1:P2SA1和p2sa235S∷P2SA2植株，发现其恢复了强蓝光诱导的拟南芥下胚轴向光弯曲表型。由上可知，P2SA1可能作为PHOT1和PHOT2下游因子，特异调节PHOT1和PHOT2介导强蓝光诱导的拟南芥下胚轴向光弯曲生长，并不调节PHOT1介导的弱蓝光诱导的拟南芥下胚轴向光弯曲，而P2SA2调节PHOT1和PHOT2介导的强弱蓝光反应。分析P2SA1可能的生物学功能，发现P2SA1基因的突变也可导致拟南芥叶表面温度低于野生型和phot1突变体约1℃，然而并不影响拟南芥叶绿体避光运动和拟南芥根负向光性生长。
　　表达分析显示，强蓝光处理显著诱导拟南芥P2SA1和PHOT2基因的表达，抑制PHOT1基因表达，且PHOT2基因的突变明显抑制强蓝光诱导的P2SA1基因表达，暗示强蓝光诱导的拟南芥向光弯曲反应主要由PHOT2调节，P2SA1可能特异调节PHOT2介导的蓝光反应。然而P2SA1并不与蓝光受体PHOT1或PHOT2互作，可与PKS1相互作用。PKS1可以与PHOT1和PHOT2发生体内体外互作，暗示PKS1可能起到桥梁的作用搭起PHOT1和PHOT2与P2SA1之间信号传递。遗传分析显示，P2SA1、NPH3、RPT2突变的拟南芥植株，类似于phot1phot2双突变体表型，缺失强蓝光诱导的下胚轴向光弯曲，而PKSs家族基因PKS1、PKS2和PKS4单基因突变没有表型，双突变下胚轴向光弯曲明显降低，三突变完全缺失向光性，类似于phot1phot2、p2sa1-1、nph3-6以及rpt2-2突变体。有趣的是，PHOT1基因突变背景下，RPT2基因的突变并不影响下胚轴向光弯曲反应，而P2SA1、NPH3或PHOT2基因的突变，可导致下胚轴丧失向光弯曲反应。蛋白互作分析显示，P2SA1并不与NPH3或RPT2相互作用，可以和PKS1、PKS2以及PKS4相互作用，而PKS1可以与NPH3体外互作。综上所述，蓝光受体PHOT1和PHOT2感知蓝光，信号传递于NPH3和P2 SA1，随后可能产生依赖和不依赖于RPT2两条信号传递途径。正常情况下，不依赖RPT2的信号通路可被PHOT1抑制，只有当PHOT1基因突变，才能解除对其抑制作用。PKSs家族蛋白在蓝光受体PHOT1和PHOT2感受蓝光刺激，向NPH3和P2SA1传递过程中扮演重要的角色。
　　生长素的不对称分布决定植物的向光性，蓝光照射引起的生长素分布不均依赖于向光素介导的信号转导途径。我们将含有生长素报告基因的DR5rev:GFP/DR5rev:GUS野生型拟南芥与p2sa1-1突变体杂交，获得p2sa1 DR5rev:GFP和p2sa1 DR5rev:GUS植株。暗处理下生长素主要分布在拟南芥黄化苗子叶弯钩处，胚轴面强蓝光单侧刺激可诱导生长素向下转移形成背光侧和向光侧生长素的不对称分布，而子叶面强蓝光单侧刺激可促使生长素先向背光侧转移，再向下运输形成生长素不对称分布。基因P2SA1的突变，可造成拟南芥缺失强蓝光诱导的生长素上述转移反应。与之相吻合的是，胚轴面和子叶面照光可导致拟南芥野生型下胚轴向光弯曲表现明显差异，然而基因P2SA1的突变，不同侧面照光拟南芥均表现为下胚轴向光弯曲缺失。该结果证实P2SA1调节生长素的运输，介导拟南芥下胚轴向光弯曲反应。蛋白互作分析显示，P2SA1并不与生长素运输载体P1N1和AUX1互作，PKS1可以与PIN1和CAM4发生体外体内互作。结合前期研究结果NPA（生长素外流载体抑制剂）抑制强蓝光诱导拟南芥下胚轴胞质Ca2+升高和向光弯曲反应，表明PKS1可能传递P2SA1介导的蓝光信号调节生长素运输，调节下胚轴Ca2+变化，介导强蓝光诱导的拟南芥下胚轴向光弯曲反应。
　　综上所述，我们成功筛选并克隆了两个基因P2SA1和P2SA2，P2SA1基因编码一个ABC家族蛋白，P2SA2被证明是NPH3的等位基因。P2SA1和P2SA2均定位于细胞质膜，参与调节强蓝光诱导的拟南芥下胚轴向光弯曲反应。研究发现P2SA1除特异调节强蓝光诱导的拟南芥下胚轴向光弯曲反应外，还参与调节气孔运动，然而并不调节拟南芥叶绿体避光运动和根负向光性反应。P2SA1对拟南芥下胚轴向光弯曲的调节依赖于其与PKS1互作，以接收PHOT1和PHOT2感知的强蓝光信号，调节生长素的横向和纵向运输，促使生长素的不对称分布，进而导致拟南芥下胚轴不对称生长，表现向光弯曲。上述结果，将为解析蓝光受体PHOT1和PHOT2下游信号调节子选择差异，探讨植物强蓝光应答过程中的信号整合与区分的基本机制提供新的线索和依据。

目录

声明

摘要

主要英文缩写表

第一章 蓝光受体向光素的发现及其生理功能

1．1 蓝光受体PHOT1和PHOT2的发现、结构及激活模式

1．1．1 PHOT1和PHOT2的发现

1．1．2 PHOT1和PHOT2结构及激活模式

1．2 PHOT1和PHOT2的亚细胞定位与调控

1．2．1 PHOT1的定位与调控

1．2．2 PHOT2的定位与调控

1．3 向光素参与调控的蓝光反应

1．3．1 气孔运动

1．3．2 叶绿体运功

1．3．3 下胚轴生长抑制

1．3．4 下胚轴向光弯曲生长

第二章 蓝光受体向光素介导拟南芥下胚轴向光弯曲信号转导

1．1 蓝光诱导下胚轴向光弯曲信号转导组份

1．1．1 NPH3

1．1．2 RPT2

1．1．3 EHB1

1．1．4 PKS家族

1．1．5 蛋白磷酸酶2A(PP2A)

1．2 生长素运输载体及其调控因子

1．2．1 生长素外流载体PIN家族

1．2．2 生长素输入载体AUX1／LAX

1．2．3 ABCB19生长素转运蛋白

1．2．4 AGC3激酶：PID，WAG1和WAG2

第三章 实验目的和意义

第四章 拟南芥PHOT2信号转导相关突变体的筛选与鉴定

1．引言

2．材料与方法

2．1．实验材料

2．2．实验方法

3．结果与分析

3．1 拟南芥下胚轴向光弯曲缺失突变体筛选条件的确立

3．2 PHOT2下游信号分子的筛选与鉴定

3．3 p2sa1和p2sa2突变体的遗传分析

3．4．P2SA2基因的图位克隆及功能鉴定

3．5．P2SA1基因的图位克隆及功能鉴定

3．6．P2SA1和P2SA2基因的功能比较

4．讨论

第五章 P2SA1调节蓝光反应的生理功能分析

1．引言

2．材料与方法

2．1．实验材料

2．2．实验方法

3．结果与分析

3．1．P2SA1基因响应蓝光的表达分析

3．2．P2SA1调节强蓝光诱导的拟南芥根负向光性生长

3．5．P2SA1参与强蓝光诱导的气孔运动调节

3．6．P2SA1不调节强蓝光诱导的拟南芥叶绿体避光运动反应

4．讨论

第六章 P2SA1调节拟南芥下胚轴向光弯曲的作用机制

1．引言

2．材料与方法

2．1．实验材料

2．2 实验方法

3．结果与分析

3．1 P2SA1调节强蓝光诱导的拟南芥下胚轴向光弯曲生长

3．2．P2SA1调节下胚轴向光弯曲与PHOT1和PHOT2关系研究

3．3．P2SA1调节下胚轴向光弯曲与NPH3、RPT2以及PKSs关系研究

3．4 P2SA1对生长素分布的调控

4．讨论

第七章 结论

参考文献

作者简介

致谢