利用高代数iPSC制备嵌合体小鼠

摘要

胚胎干细胞(ES)具有全能性，可以在特定的条件下诱导成为其他类型的细胞，ES细胞的特性让它在模式动物建立及细胞治疗方面有着广阔的应用空间。但是ES细胞在人类的应用上存在着伦理道德等问题，因此ES的研究只能停留在动物层面上。诱导型多功能干细胞(iPSC)的出现再次让科学家们对干细胞产生了浓厚的兴趣。iPSC同ES细胞一样都具有全能性，并且避开了ES细胞研究在伦理方面的局限，同时为细胞治疗及转基因动物方面的研究提供了有力的保障。
　　随着研究的深入获得iPSC的方法越来越多但是效率却仍然很低，虽然我们一直在努力的优化方法但是获得iPSC依然不容易。最关键的是iPSC在应用上受到代数的影响，有研究认为高代数的iPSC因为无法保证其全能性，所以在应用上高代数的iPSC的潜力被忽略了。本实验通过对IP2-19第40代这株细胞制备嵌合体小鼠证明高代数的iPSC依然具有良好的全能性。
　　我们利用不同的方法获得不同时期的胚胎，比较他们发育到囊胚的情况。利用体外授精的方式获得原核期胚胎，在体外进行培养，直至发育到囊胚期;其次通过正常交配取得2-cell胚胎然后体外发育至囊胚;第三种方式是通过正常交配让胚胎在体内发育到囊胚期后冲胚获得，胚胎在体内完成发育过程。实验结果表明:在使用相同数量小鼠的前提下，通过体外授精的方法发育到囊胚期的胚胎数量最多，平均55.2枚胚胎/4只小鼠;而通过正常交配的小鼠1.5d取胚胎平均为52.25枚胚胎/4只小鼠;而通过正常交配取3.5d的胚胎则38.2枚胚胎/四只小鼠。正常交配1.5d获得胚胎发育到囊胚是77％士7％比体外授精的方式（73％±7％）稍高，但是体外授精的方式获得的囊胚数比1.5d取胚比率要高，而且两者跟冲胚获得囊胚数相比差异显著。
　　我们采用手动和用陶瓷破膜仪(pizeo)两种方法分别对囊胚进行注射，其中通过pizeo囊胚注射后胚腔塌陷后重新形成囊胚率73.8％要高于手动注射的59.1％。我们将注射后的囊胚进行移植，有一只假孕鼠产仔，共产仔8只，有一只是阳性鼠其余为阴性阳性率为12.5％。小鼠出生后生长正常没有出现异常。本实验中，进一步挖掘了iPSC的发展和应用空间，通过制备健康的嵌合体小鼠证明iPSC在高代数的情况下，依然保持良好的全能性。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 胚胎干细胞(ES细胞)概念

1．1．1 ES细胞的发展与应用

1．1．2 ES细胞面临的问题

1．2 诱导多功能性干细胞(iPSC)

1．2．1 诱导多功能性干细胞概念

1．2．2 iPSC的发展历程

1．2．3 iPSC的研究与应用

1．3 基因随机整合制备转基因小鼠的方法

1．3．1 逆转录病毒感染转法

1．3．2 精子载体法

1．3．3 原核注射

1．4 基因定位打靶制备嵌合体动物方法

1．5 立体依据及意义

2 材料和方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验选用小鼠

2．1．2 实验选用细胞

2．2 实验所用仪器及设备

2．2．1 实验仪器

2．2．2 实验耗材

2．3 实验试剂

2．3．1 基础试剂

2．3．2 实验配制试剂

2．4 实验方法

2．4．1 CD1雄性结扎小鼠的制备

2．4．2 收集CD1小鼠胚胎并培养

2．4．3 显微注射操作针的制备

2．4．4 细胞制备与培养

2．4．5 胚胎进行显微注射

2．4．6 胚胎移植

3 结果与讨论

3．1 细胞方面的结果与讨论

3．1．1 用CF1及DR4小鼠成纤维细胞制备滋养层

3．1．2 iPSC细胞的培养

3．2 显微注射针的制备

3．3 所用实验小鼠的结果与讨论

3．3．1 结扎雄性小鼠

3．3．2 供体及受体CD1小鼠

3．4 早期胚胎的体外培养

3．4．1 小鼠胚胎在体外的培养

3．4．2 不同时期获得胚胎发育到囊胚的比较

3．5 胚胎注射

3．6 胚胎移植嵌合体小鼠制备

4 结论

参考文献

致谢