菊花提取物对人血管内皮细胞TIPE2、PCNP基因表达的影响

摘要

以粥样硬化为基本病理改变的心脑血管疾病目前已是我国国民死亡首因，且随着我国工业化水平的提高，居民物质生活条件的改善，其发病有年轻化和逐年增多趋势。动脉粥样硬化的发病机制尚未完全阐明，目前得到普遍认可的是炎症反应学说。该学说认为：动脉粥样硬化是血液内成分（单核巨噬细胞系统、血小板、T淋巴细胞、血浆脂蛋白等）与动脉管壁成分（血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、细胞外基质等）等多种因素相互作用的慢性炎性疾病。大量研究已证实炎症介质、生长（细胞）因子在粥样硬化斑块形成中的作用。然而，基于上述认识所研发的临床治疗手段依然有限，基础医学理论向临床实践应用的转化并不成功。尽管目前已有的药物治疗、介入治疗等手段，急性冠脉综合征患者3年内心肌梗死的发生率仍然高达20％左右，寻找一种有效且经济、易于被患者接受的手段来预防、延缓甚至治疗动脉粥样硬化，降低其发病率和死亡率显得迫在眉睫。血管内皮细胞损伤是动脉粥样硬化发生的始动步骤，内皮细胞功能障碍贯穿于动脉粥样硬化发展的全过程。TIPE2是TNFAIP8家族中的一成员，在维持免疫稳态中发挥着至关重要的角色。TIPE2作用于T细胞受体和Toll样受体信号通路，负性调节炎症反应。PCNP是一种核蛋白，参与细胞周期调控，是细胞增生相关信号转导通路中的效应分子。在粥样硬化进程中，自始至终都存在炎症反应、细胞增生等生物学过程，我们推测TIPE2、PCNP基因可能参与其中。在我国，菊花用来治疗炎性疾病已有数千年的历史，现代医学研究业已证明，提取自菊花的总黄酮、芹黄素等能够减少炎性介质的生成，抑制肿瘤细胞的增生，抗动脉粥样硬化，但是人们对这些功能作用的分子机制却知之甚少。
　　目的:本文旨在通过用菊花提取物作用于人血管内皮细胞（主动脉及冠脉动脉内皮细胞），观察细胞TIPE2、PCNP在基因和蛋白水平上表达量的变化，并为进一步探讨菊花提取物发挥抗炎、抗粥样硬化等功能作用的分子机制提供理论依据。
　　方法:首先使用 MTT比色法确定实验选用的三种浓度的菊花提取物（ Chrysanthemum indicum extract，CIE）对体外培养的人主动脉内皮细胞（human aortic endothelial cell，HAEC）和人冠状动脉内皮细胞（human coronary artery endothelial cell，HCAEC）生长率的影响。再向细胞培养基中加入不同浓度的菊花提取物，同时设立空白对照组。分别在细胞培养24h，48h，72h这三个时间点，采用Trizol法提取细胞总RNA，通过RNA逆转录和cDNA的实时荧光定量PCR技术（Real-time PCR），观察TIPE2、PCNP mRNA表达水平；提取细胞总蛋白，通过蛋白免疫印迹法（Western Blot），观察TIPE2、PCNP蛋白表达水平。
　　结果:
　　1.Real-time PCR检测基因表达：CIE处理后，HAEC和HCAEC细胞内TIPE2 mRNA表达均高于未用CIE处理的空白对照组，与CIE浓度呈正相关关系，差异具有统计学意义（P<0.05），与CIE作用时间无关。PCNP mRNA表达则无明显影响（P>0.05）。
　　2.Western Blot检测蛋白表达：CIE处理后，HAEC和HCAEC细胞内TIPE2蛋白表达量均高于未用CIE处理的空白对照组，与CIE浓度呈正相关关系，差异具有统计学意义（P<0.05），与CIE作用时间无关。PCNP蛋白表达则无明显影响（P>0.05）。
　　结论:菊花提取物可以上调人主动脉及冠状动脉内皮细胞TIPE2基因表达，而对PCNP基因表达无明显影响。

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英文缩略词表

前言

1 材料、试剂和仪器

1.1 主要试剂

1.2 主要配制试剂

1.3 主要仪器

2 实验方法与步骤

2.1 菊花提取物溶液的制备

2.2 内皮细胞存活率检测

2.3 实验分组

2.3.1 HAEC分组

2.3.2 HCAEC分组

2.4 基因表达的检测

2.4.1 细胞总 RNA 的提取

2.4.2 RNA反转录为cDNA

2.4.3Real-time PCR扩增目的基因

2.4.4 琼脂糖凝胶电泳

2.5 蛋白质的检测

2.5.1 细胞内蛋白提取

2.5.2 BCA法蛋白浓度测定

2.5.3 Western Blot

2.6 统计学分析

3 实验结果

3.1 MTT法检测细胞存活率

3.2 Real-time PCR检测基因表达

3.3 Western Blot检测蛋白表达

4 讨论

结论

参考文献

综述:动脉粥样硬化研究的新进展

致谢