miRNA-152在2型糖尿病发病中的作用机制研究

摘要

背景：miRNAs通过调控胰岛β细胞的分化，胰岛素的合成与分泌，胰岛素信号转导等途径参与调节葡萄糖的摄取和血糖的平衡，在2型糖尿病（T2DM）的发生、发展及并发症的出现中发挥重要作用。因此，鉴定新的miRNA分子并揭示其在2型糖尿病发病中的作用机制具有重要的价值。
　　目的：以2型糖尿病患者和健康人的外周血液为对象，研究miRNA-152分子在两组人群中的差异，分析其表达水平与糖尿病临床指标之间的相关性；利用生物信息学分析和细胞实验，筛选出可能受到 miRNA-152直接调控的靶基因，构建含有靶基因序列的重组质粒，进一步验证miRNA-152对靶基因的调节作用，揭示miRNA-152在T2DM发生中的作用及其机制。
　　方法：⑴采集年龄相仿的健康献血者和未经治疗、且无并发症的T2DM患者的空腹外周血，EDTA抗凝处理后置于-80℃保存备用。同时收集两组人群的血液临床生化检测数据及T2DM患者的病历资料。⑵在血液RNA中加入外参基因，使用Trizol法提取血液总RNA，加A尾反应使miRNA修饰上Poly(A)尾，逆转录反应得到miRNA的cDNA。⑶利用荧光定量PCR技术鉴定两组人群中 miRNA-152表达水平的差异。利用miRNA-152正向引物和反向通用引物扩增miRNA-152分子，同时扩增外参基因作为对照，分析miRNA-152分子水平在两组人群中的表达差异。⑷根据两组人群的临床血液生化数据，分析miRNA-152水平分别与空腹血糖水平、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、个体肥胖指数等糖尿病指标之间的相关性。⑸使用权威的miRNA靶基因预测软件：DIANA TOOLS、miRanda和TargetScan，筛选可能受到miRNA-152调控且与T2DM发生相关的潜在靶基因。⑹在肝癌HepG2细胞中转染miRNA模拟物miRNA-152mimic，同时转染NC-mimic作为阴性对照。荧光定量PCR检测miRNA-152在细胞中的表达水平，以U6作为内参基因。同时检测过表达miRNA-152后靶基因的表达情况，以actin作为内参基因。初步将表达水平下调明显的基因作为靶基因。⑺分析靶基因mRNA的3’非翻译区域（3’UTR区域），确定其可能与miRNA-152结合的潜在区域。设计加入双酶切位点的引物，采用PCR方法扩增出编码靶基因3’UTR区域的部分DNA片段，双酶切后克隆入pmirGLO双荧光素酶报告基因载体；菌落PCR鉴定阳性克隆，测序确定载体是否构建成功。⑻将空载体和重组载体分别与miRNA-152 mimic或NC-mimic在HepG2细胞中进行共转染，转染后24小时进行双荧光素酶基因报告实验，检测不同组细胞荧光素酶活性的变化情况，在细胞内确定miRNA-152对靶基因的直接调控作用。
　　结果：①miRNA-152在正常和 T2DM人群中的表达差异：荧光定量 PCR结果显示miRNA-152分子在T2DM患者中呈异常高表达，升高达1.4倍左右。进一步分析显示， miRNA-152分子水平与两组人群的空腹血糖水平呈显著正相关，与高密度脂蛋白水平呈明显负相关，但与甘油三酯水平、低密度脂蛋白、总胆固醇水平及肥胖指数并无明显相关性。②筛选miRNA-152的潜在靶基因：利用生物信息学分析，初步筛选出8个与T2DM发生相关且可能受到miRNA-152调控的潜在靶基因。③过表达miRNA-152后对潜在靶基因的影响：在HepG2细胞中转染miRNA-152 mimic后发现，miRNA-152在细胞中过量表达近百倍左右。miRNA-152水平升高后靶基因ADAM17、CSF1和MET的表达水平均发生下调。④靶基因重组载体的构建：进一步的生物信息学分析显示，CSF1和MET两个基因mRNA的3’UTR区域都含有多个与miRNA-152种子区潜在结合的位点。利用分子克隆的方法，将编码这两个基因3’UTR区域的DNA片段克隆入pmirGLO载体，测序结果显示两个重组质粒均构建成功。⑤双荧光素酶报告基因实验确定miRNA-152对靶基因的直接调控作用：共转染后的双荧光素酶报告基因实验显示， CSF1和MET的重组载体分别与miRNA-152转染后均能够检测到荧光素酶活性的明显下降，说明miRNA-152直接参与了CSF1和MET基因表达的调控。
　　结论：⑴分析健康人群和T2DM人群的临床样本后发现，miRNA-152在T2DM患者的血液中呈异常高表达，且miRNA-152分子水平与两组人群的空腹血糖水平呈显著正相关，与高密度脂蛋白水平呈明显负相关。⑵确定CSF1和MET可能是miRNA-152直接作用的靶基因，提示过量表达的miRNA-152可能通过抑制这些基因的表达参与T2DM的发生。

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前言

1 材料、试剂和仪器

1.1 实验血液标本和细胞

1.2 主要试剂

1.3 主要试剂配制

1.4 仪器

2 实验方法与步骤

2.1 血液样本RNA的提取

2.2 RNA 加A尾

2.3 Poly（A）修饰的miRNA进行逆转录反应

2.4 引物稀释

2.5 荧光定量PCR

2.6 细胞培养

2.7 细胞转染

2.8 HepG2细胞RNA的提取

2.9 cDNA逆转录

2.10 荧光定量PCR

2.11 HepG细胞DNA的提取

2.12 分子克隆

2.13 质粒小提

2.14 质粒大提

2.15 双荧光素酶报告基因实验

2.16 统计学分析

3 结果

3.1 miR-152在T2DM及健康人群外周血液中表达情况

3.2 miR-152水平与两组人群糖尿病临床指标及个体BMI的相关性分析

3.3 生物信息学预测miR-152的靶基因

3.4 HepG2细胞转染miR-152 mimic后检测其表达水平

3.5 细胞水平上过表达miR-152对靶基因的影响

3.6 生物信息学预测miR-152与靶基因的潜在结合位点

3.7 靶基因重组克隆载体的构建

3.8 双荧光素酶报告基因实验鉴定miR-152对靶基因的直接调控作用

4 讨论

5 结论

参考文献

综述:miRNA在糖尿病中的研究进展

致谢