ATP13A2参与突触核蛋白synuclein病理学作用机理研究

摘要

Parkinson’s Disease（PD）是一种多系统功能障碍为主要表现的神经系统变性疾病，病理学特征是黑质多巴胺能神经元损失和路易体（Lewy body）形成。氧化应激、蛋白质误折叠和聚集的增多都涉及在PD的病理学变化中，而多巴胺能神经元退化的精确描述仍存在空缺。越来越多的遗传和生化研究揭示自噬溶酶体途径的功能障碍在帕金森病（PD）发病机制中有重要作用。目前，大多数研究集中在突触核蛋白次级聚集引起的神经毒性累积。在依赖于年龄的PD病人中，出现了溶酶体功能的损伤。这表明自噬溶酶体系统的缺陷似乎也可通过多种机制引起自噬神经毒性。ATP13A2在哺乳动物中脑有很高的表达量，其突变可导致被称作Kufor–Rakeb syndrome(KRS)的神经退行性疾病。ATP13A2部分定位于溶酶体膜，推测其功能为阳离子转运体。ATP13A2突变后对自噬溶酶体途径是否有影响，突变的ATP13A2是否参与突触核蛋白病理学，促进神经元的退化还尚未可知。
　　为了探究这些问题，构建了ATP13A2野生及突变的稳转B103神经母细胞瘤细胞株，研究ATP13A2突变基因对神经元的损伤作用，以及对自噬溶酶体途径的影响。同时在β-syn稳转B103细胞株中，过表达ATP13A2野生及突变质粒，研究在ATP13A2作用下，突触核蛋白病理学的变化。
　　通过免疫荧光及免疫印迹技术，在ATP13A2稳转B103细胞株中发现：野生型ATP13A2呈聚集状态并主要定位于溶酶体，过表达ATP13A2野生型蛋白后，轻微的降低溶酶体的活性。而突变型ATP13A2蛋白在B103细胞中出现部分弥散的现象，在溶酶体的定位程度增高，显著降低了溶酶体活力。突变ATP13A2蛋白在内质网积留，引起内质网应激，并引起线粒体连续性降低，减弱了线粒体融合能力。ATP13A2突变蛋白引起自噬，主要通过自噬溶酶体系统降解。在β-syn稳转B103细胞株中，过表达突变型ATP13A2蛋白后，抑制了突触核蛋白降解，促进突触核蛋白聚集。LDH和WST-1显示，ATP13A2突变蛋白有明显的神经毒性作用。
　　总的来说，ATP13A2在维持细胞内溶酶体活性方面有着重要作用，突变型ATP13A2引起内质网应激，线粒体连续性降低，增加了神经毒性。同时突变ATP13A2降低突触核蛋白降解，促进突触核蛋白聚集形成包涵体，加剧了突触核蛋白引起的神经退化。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

1.引言

1.1帕金森病

1.2 ATP13A2 \(PARK9\)

1.2.1 ATP13A2的功能与分布

1.2.2 ATP13A2突变与帕金森症

1.3突触核蛋白病理学

1.3.1 β-synuclein与α-synclein

1.3.2 β-syn与PD

1.4自噬

1.4.1 自噬与自噬信号通路

1.4.2帕金森病与自噬

1.4.3 ATP13A2与自噬

2.材料和方法

2.1 ATP13A2野生及稳转质粒的提取及鉴定

2.1.1 主要仪器与设备

2.1.2 试剂及配制方法

2.1.3实验步骤

2.2 ATP13A2及β-syn质粒的表达与稳转细胞系的建立

2.2.1主要仪器与设备

2.2.2 常用试剂及配制

2.2.3 B103细胞抗药性能力评估：

2.2.4 转染、药杀

2.2.5 单克隆挑取

2.2.6 免疫印迹样品蛋白裂解

2.2.7免疫印迹

2.3免疫荧光双标及细胞增殖、凋亡检测、酶活力检测、线粒体提取

2.3.1 主要仪器与设备

2.3.2 主要试剂及配制方法

2.3.3 LDH细胞毒性检测

2.3.4 WST-1细胞存活率检测

2.3.5 免疫细胞化学

2.3.6 组织蛋白酶D及26-S蛋白酶体活性测定

2.3.7线粒体提取

2.3.8数据分析统计软件及方法：

3.结果与讨论

3.1 ATP13A2真核表达质粒的提取鉴定

3.2 ATP13A2在B103细胞中的分布

3.3 ATP13A2在各细胞器中的分布以及对各细胞器的影响

3.4 ATP13A2与突触核蛋白病理学

4.结论与展望

帕金森病中的溶酶体损伤

1. GBA

2. ATP13A2

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文目录