黄萎病相关的拟南芥突变体的筛选分析及黄萎病的生物防治

摘要

棉花黄萎病是由黄萎病菌引起的维管束系统疾病，该病分布广泛、危害严重，已成为制约棉花生产的关键因素。因此，揭示黄萎病发病的分子机制、寻找抗病防病的方法和手段是实现棉花稳产高产的重要保证。研究表明模式植物拟南芥幼苗感染黄萎病菌后会出现叶片萎黄，叶脉透化，生长周期缩短或植株矮小等典型症状，是很好的黄萎病研究材料。本文利用拟南芥的突变体筛选和分析方法，寻找植物的抗病基因，揭示植物黄萎病的发病机制，同时也利用筛选得到的芽孢杆菌开展棉花黄萎病的生物防治研究工作。
　　1、突变体的筛选
　　本实验利用课题组已建立的黄萎病敏感型拟南芥突变体筛选体系，对EMS诱变拟南芥种子突变体库进行筛选，寻找与黄萎病抗性有关的拟南芥突变体。筛选过程为选取苗龄9天的拟南芥幼苗，在其根尖处接种1μL大丽轮枝菌Vd991的孢子悬浮液(浓度5×105个/mL)，接种后8-12天，部分拟南芥会出现黄萎病的相关病状，这些植株可能是黄萎病相关的突变体。本实验从约45200多株EMS诱变拟南芥种子突变体库中筛选得到300多株黄萎病相关的拟南芥株系。经过验证得到黄萎病病症稳定拟南芥突变体se348、se579和se346，并对其展开进一步的分析。
　　对突变体se348的分析表明：在MS培养基上对苗龄为9天的se348幼苗及野生型Col-0接种Vd991病原菌，接种后8天，se348的子叶首先褪绿萎黄，随病原菌处理时间增加，子叶白化干枯，真叶开始出现萎黄症状；进一步的分析发现，se348花青素积累较少，叶绿素含量显著降低。se348表现出比野生型明显黄萎病症状。利用叶片提取物培养的方法分析表明，se348突变体叶片中的病原菌数量是野生型的4.2倍。对拟南芥根部蘸菌接种移土培养54天，发现se348植株矮小，生长周期缩短。说明se348突变体对黄萎病菌比较敏感。
　　对突变体se579的分析表明：在MS培养基上对苗龄为9天的se579幼苗及野生型Col-0接种Vd991病原菌。接种后8天，se579子叶褪绿萎黄，叶脉透化；随着处理时间的增加，se579的子叶白化干枯，部分真叶变褐枯死，花青素含量低于野生型，叶绿素含量显著降低。利用叶片提取物培养的方法分析表明，se579叶片中病原菌数量是野生型的4.75倍。对拟南芥根部蘸菌接种移土培养56天，发现突变体se579植株矮小，分蘖较多。说明se579是黄萎病敏感型突变体。
　　对突变体se346的分析表明：在培养基上对苗龄为9天的se346幼苗及野生型Col-0接种Vd991病原菌。接种后8天，se346植株矮小，但并未出现萎黄现象，花青素自叶柄处开始积累。接后种20天，se346花青素含量比未接种的se346增加了4.9倍，叶绿素含量变化不明显。利用叶片提取物培养的方法分析表明，se346叶片中病原菌数量与野生型相近。对拟南芥根部蘸菌接种移土培养20天，发现突变体se346能够正常生长，长势要明显优于野生型。推测se346可能是对黄萎病有抗性的突变体。
　　2、突变体se346的遗传分析和基因克隆
　　遗传学分析显示，Col-0背景的突变体se346和野生型Ler杂交的F1代性状与Ler一致， F1代自交产生的F2代出现性状分离，分离比接近3:1，说明突变体se346为单基因隐性突变。图位克隆分析表明， se346的突变位点可能定位在2号染色体中下端的分子标记T20P8(11500526-11599871bp)的附近。基因测序结果显示，se346基因编码区第52位的C碱基突变为T碱基，导致se346基因翻译提前终止，其编码的蛋白不能合成，但其具体的抗病机制有待进一步研究。
　　3、棉花黄萎病的生物防治
　　短小芽孢杆菌Y106是对棉花黄萎病菌有抑制作用的细菌菌株。平板对峙实验显示， Y106与黄萎病菌Vd991共同培养至10天时，黄萎病的菌落直径为3.85 cm，比对照组减小了39.27％，说明Y106菌株对棉花黄萎病菌的生长有较强的抑制作用；Y106和带有绿色荧光蛋白基因标记的棉花黄萎病菌Vd-gfp77在PDA液体中共同培养表明，随着Y106菌浓度增加，Vd-gfp77菌液在发射光为530 nm处的荧光强度从217.43下降至97.49，说明随着Y106菌浓度升高，Vd-gfp77菌液浓度降低，表明Y106对黄萎病菌生长有较明显的抑制。土壤中共培养实验显示，随着Y106浓度的增加，土壤中黄萎病菌菌落数目从79个而减少到44个，比不加Y106的对照组菌落数目减少44.3%，说明在土壤中Y106菌株对棉花黄萎病菌的增殖有抑制作用。Y106菌株对盆栽棉花黄萎病的防治实验显示，Y106菌株可以使盆栽棉花黄萎病的病情指数降低32.3%。以上表明短小芽孢杆菌Y106对棉花黄萎病菌有较强的的抑制作用，可用于棉花黄萎病的生物防治。

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缩略词

1 前言

1.1 棉花黄萎病

1.2 棉花黄萎病菌的致病机制

1.3 棉花对黄萎病的抗病机制

1.4 与黄萎病菌相关的抗性基因

1.5 棉花黄萎病的生物防治

1.6 立题依据

2材料与方法

2.1 实验仪器

2.2 实验材料

2.3 实验试剂

2.4 DNA测序及引物合成

2.5培养基及溶液的配制

2.6 实验方法

2.7 短小芽孢杆菌Y106对棉花黄萎病的生物防治

3 结果与分析

3.1黄萎病相关的拟南芥突变体筛选条件的建立

3.2黄萎病相关的拟南芥突变体的初步筛选

3.3 黄萎病敏感型突变体se348的表型分析

3.4 黄萎病敏感型突变体se579的表型分析

3.5 抗性突变体se346的表型分析

3.6 短小芽孢杆菌对棉花黄萎病的生物防治

4 讨论

5 结论

参考文献

致谢