拟南芥黄萎病菌敏感型突变体的筛选与分析

摘要

棉花黄萎病是由黄萎病菌引起的一种土传病害，世界各大棉区均有分布，我国的棉花黄萎病主要由大丽轮枝菌引起的。大丽轮枝菌寄主广泛，且容易发生变异，致病力分化较明显，致病机理复杂，目前缺乏有效的防治药物，再加上抗源材料的匮乏，使得棉花黄萎病的防治变得愈加艰难。运用现代分子生物技术培育抗病棉品种将成为解决这一难题的一个可行途径。当用大丽轮枝菌侵染拟南芥幼苗时，幼苗植株会出现子叶萎黄，花青素积累，植株发育矮小等典型的黄萎病症状。棉花的基因组庞大，生长周期长等特点，使得发掘棉花抗性基因的进展缓慢。而模式植物拟南芥因为基因组小等优点在研究棉花抗黄萎病的机制上具有很大的发展前景。
　　本研究将T-DNA库的种子点于含琼脂浓度为0.6％的MS培养基上，春化3 d，培养12 d后，将生长良好的幼苗移入土中，成熟后单株收种子并编号。因为课题组筛选的是敏感型突变体，而表型好的敏感型突变体多会因为发病严重而死亡。这个方法的优点就在于即使表型好的突变体死亡，也可以根据事先的种子编号进行下步实验。将收到的种子按编号点在含琼脂浓度为0.6%的MS培养基上，材料室生长8d后，将拟南芥幼苗摆在含琼脂浓度为1%的MS培养基上，在幼苗的根尖处滴1μL浓度为5×105个孢子/mL的黄萎病菌孢子悬浮液，菌处理8-10 d，拟南芥幼苗开始出现黄萎病的症状，这些是对黄萎病菌敏感的突变体，将其移入土中观察其在土中的生长情况。本实验从突变体库中筛选到3株能稳定遗传的突变体：sr1、s63和s133，这为研究棉花的抗黄萎病机制提供了实验材料。正常培养基上生长8d的突变体sr1在培养基上接种8-12d后发病较野生型WT严重，植株叶片先是褪绿，接着萎黄后枯黄，接种20d后，子叶干枯程度较WT严重，植株生长发育矮小。将接种9 d的幼苗移植到土壤生长22d后发现，和野生型WT相比其在土壤中生长受限，植株发育矮小，说明突变体sr1对黄萎病菌敏感。突变体sr1在培养基上病原菌处理12d后，从其叶片中分离的菌落形成数量是野生型的8倍，说明突变体sr1对黄萎病菌敏感的原因是由侵入其体内的菌落数量所致。实验还发现突变体萌发较野生型要慢，根长明显短于野生型，抽薹时间比WT晚，后期生殖阶段和WT的差异不显著。土壤中生长30d后，二者地上部分的鲜重区别不大，同时统计了二者的根长，发现差异不明显。进一步研究发现缺铵处理一定程度上能恢复突变体sr1的根长。实验还发现突变体根短的原因是伸长区细胞长度变短所致。遗传分析表明突变体sr1是单基因隐性突变，通过图位克隆的技术分析得知该基因位于5号染色体上端。突变体s63在正常培养基上生长8d，用黄萎病菌处理8 d后，子叶比野生型要先褪绿，接着萎黄；随着接种处理时间的增加其子叶开始干枯，植株叶片干枯的数量也开始增多；同时植株花青素积累程度随着时间的增加而加剧。接种40d左右，植株先于WT抽薹，生命周期缩短。土壤接种32d后，s63叶片萎蔫枯黄程度比WT明显。培养基中接种18d后野生型WT的相对花青素含量是s63的1.4倍。菌处理9d后，子叶叶绿素含量下降幅度是野生型的2.5倍，结果表明突变体对黄萎病菌敏感。从突变体s63在培养基上接种12d的叶片中分离出的菌落数量约是WT的7倍，说明突变体s63对黄萎病菌敏感的原因是由侵入其体内的菌落数量所致。台盼蓝染色结果表明培养基上处理8d的幼苗，其不管根尖还是子叶死细胞均多与野生型。这说明s63是对黄萎病菌敏感的突变体。突变体s133的表型与s63相似，培养基上黄萎病菌处理8 d后，子叶先于野生型褪绿萎黄，随着处理时间的增加子叶开始干枯；同时花青素积累程度逐渐加剧。接种45 d后植株叶片干枯程度较WT严重，抽薹开花时间早于野生型WT；20d大的幼苗土壤中接种处理生长32d后，植株叶片失水萎黄严重，比野生型敏感。培养基上接种18d后野生型WT的相对花青素含量是s133的1.7倍。接种9d后的子叶的叶绿素含量下降幅度是WT的1.5倍。结果说明s133对黄萎病菌敏感。

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缩略词

1 前言

1.1 棉花黄萎病的简介

1.2 棉花黄萎病菌的致病机制

1.3 棉花抗黄萎病菌的作用机制

1.4 棉花抗黄萎病菌基因

1.5 植物的根系发育

1.6 立题依据

2 材料与方法

2.1 实验仪器

2.2 实验材料

2.3 实验试剂

2.4 DNA测序及引物合成

2.5 常用培养基及溶液的配置

2.6 实验方法

3 结果与分析

3.1 敏感型突变体筛选条件的建立

3.2 黄萎病菌敏感型突变体的筛选

3.3 黄萎病菌敏感型突变体sr1的初步分析

3.4 敏感型突变体s63的初步分析

3.5 敏感型突变体s133的初步分析

4 讨论

4.1 拟南芥黄萎病菌敏感型突变体筛选条件的建立与优化

4.2 拟南芥黄萎病敏感型突变体的分析

5 结论

参考文献

致谢