含非离子亲水基团的吲哚菁染料的合成、光学性质及生物应用

摘要

目的：多甲川菁染料，尤其是多甲川吲哚菁荧光染料，具有最大紫外吸收和荧光发射波长处于近红外区、波长可调谐范围大、摩尔消光系数高、荧光量子产率较高、无放射性、信噪比高和能有效避开生物体自身荧光干扰等优点，已成为生命科学领域研究的热点，可应用于蛋白检测、细胞成像、肿瘤靶向治疗和DNA芯片等生物医学领域。但是，目前已开发的吲哚菁荧光染料难以满足生命科学的应用需要，研究开发性能更为优良的吲哚菁染料，在生命科学领域具有重要意义。吲哚菁染料存在着分离提纯困难、水溶性差、易发生光漂白和荧光淬灭等缺点。我们在染料分子吲哚环“N”位引入一种含PEG醚链的非离子亲水基团，合成一系列新型吲哚菁染料，研究引入该基团后对染料的分离提纯、光学性能及生物应用方面的影响，以期获得合成方便简单、光学性能更为优良和生物应用效果更佳的吲哚菁荧光染料。
　　方法：以聚三乙二醇、对甲基苯磺酰氯、磺酸苯肼等为起始原料，合成了一种非离子亲水烷基化试剂，向吲哚环“N”位引入该基团，采用“一步法”和“半菁法”分别合成了1种三甲川吲哚菁染料（Cy3-569）和3种五甲川吲哚菁染料（Cy5-668、Cy5-669、Cy5-671），并分别对它们进行了活化。用紫外-可见分光光度计、荧光分光光度计及碘钨灯等光学仪器分别对4种染料进行光学性能和光稳定性的测试，并进行对比。用4种染料的活化酯分别对牛血清白蛋白进行共价标记，检测和计算染料-蛋白共价结合的比率，并进行对比。选取 Cy5-669对人肝癌固定细胞和活细胞进行染色，观察并对比其对固定细胞和活细胞的染色效果。
　　结果：合成了12种染料中间体和4种目标染料，分别用1H NMR、MS等对化合物进行了结构表征，确定为目标化合物。分别测试了Cy5-668、Cy5-669、Cy5-671及Cy3-569的光谱性能和光稳定性，发现它们在水中的最大紫外吸收波长分别为647 nm、648 nm、650 nm及553 nm。在水中的最大荧光发射波长分别为668 nm、669 nm、671 nm及569 nm；在水中的斯托克斯位移分别为21 nm、21 nm、21 nm及16 nm；在水中的摩尔消光系数分别为1.4×105/M-1cm-1、1.9×105/M-1cm-1、1.6×105/M-1cm-1及0.9×105/M-1cm-1；在水中的荧光量子产率分别为0.09、0.13、0.24及0.07。4种染料经碘钨灯光照8 h后，光稳定性强弱顺序为Cy3-567>Cy5-671>Cy5-669>Cy5-668，光降解率分别为3.2％、23.5%、31.9%及37.3%。用4种染料活化酯分别标记牛血清白蛋白， n(染料)：n(牛血清白蛋白)=5、10或20时，Cy3-569与蛋白共价标记率分别为1.15、1.57和2.14；Cy5-668与蛋白共价标记率分别为1.12、1.59和2.11；Cy5-669与蛋白共价标记率分别为1.16、1.75和2.16；Cy5-671与蛋白共价标记率分别为1.14、1.86和2.54。选取Cy5-669对人肝癌固定细胞和活细胞染色，结果发现，染料能透过固定细胞膜对整个细胞染色，对细胞核染色最为明显且核仁清晰可见，荧光明亮；染料仅有少量透过活细胞膜进入细胞内部，大部分聚集于细胞膜表面，可清晰观察到细胞外周轮廓且荧光明亮。该染料对固定细胞和活细胞染色结果有很大差异，对细胞形态和生存状态有较好的区分度。
　　结论：向吲哚菁染料吲哚环“N”位引入“枝状非离子亲水基团”后，可有效降低染料分子分离提纯难度，用常规正相硅胶柱即可实现对目标产物的分离提纯；与不含“枝状非离子亲水基团”的染料相比，荧光量子产率、水溶性和光稳定性有大幅度提高，可有效标记蛋白质；其中Cy5-669可对人肝癌固定细胞和活细胞进行染色，荧光明亮，对细胞形态和细胞生存状态有较好的区分度，在细胞成像及细胞凋亡研究领域有很大的应用潜力。

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1 文献综述

1.1 引言

1.2 菁染料的类型

1.3 吲哚菁染料的合成方法

1.4 吲哚菁染料的性质

1.5吲哚菁染料的生物应用

1.6 本文研究意义和内容

2 合成部分

2.1 仪器

2.2 试剂

2.3 不对称五甲川吲哚菁染料的合成

2.4 不对称三甲川吲哚菁染料的合成

3 染料光学性能的测试

3.1 仪器与试剂

3.2 测试方法

4 染料共价标记蛋白质

4.1 仪器与试剂

4.2 蛋白荧光标记方法

5 细胞染色

5.1 仪器与试剂

5.2 染色方法

6 结果与讨论

6.1 合成部分

6.2 光学性能

6.3 蛋白标记

6.4 细胞染色

结论

参考文献

附图

致谢

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