血小板反应蛋白1对小鼠原代肝细胞脂代谢的影响

摘要

背景：
　　近年来，非酒精性脂肪肝（Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是世界上最普遍的慢性肝脏疾病。而有很多种原因可以引起非酒精性脂肪肝，胰岛素抵抗与非酒精性脂肪肝的危险因素关系很密切，几乎大部分的非酒精性脂肪肝患者都存在有在周围组织和肝脏的胰岛素抵抗，并且胰岛素抵抗的严重程度与非酒精性脂肪肝的病情进展相关。因此，胰岛素抵抗在非酒精性脂肪肝的发病机制中起着很重要的作用。发现，在肥胖和胰岛素抵抗的患者体内，血小板反应蛋白1（TSP1）被高度表达，并且和脂肪组织的炎症非常相关。根据文献，在高脂饮食诱导肥胖的小鼠模型中，相较于野生型小鼠，TSP1基因的缺失可以显著的提高胰岛素的敏感性并减少有关的炎症；可以改善高脂饮食诱导的肝脏的脂滴蓄积，以及脂肪性肝炎。肝脏作为胰岛素作用的位点之一，也是脂质代谢的重要器官。但是，TSP1是否减弱了肝细胞对胰岛素的敏感性，TSP1基因的缺失是否会改善肝细胞的脂质代谢，因此，本实验就选用野生型小鼠和TSP1基因缺失型小鼠作为研究对象，来探究TSP1蛋白是否会减弱肝脏细胞对胰岛素的敏感性，以及TSP1基因的缺失会改善原代肝细胞的脂质代谢。
　　目的：
　　探究TSP1在肝细胞对胰岛素敏感性中起的作用，以及TSP1基因的缺失对肝细胞脂质代谢的影响。
　　方法：
　　选用年龄相匹配的C57BL/6和TSP1基因缺失型的雌性小鼠，同时采用两步灌流法分离培养原代肝细胞。将从野生型小鼠体内分离得到的原代肝细胞分为对照组，胰岛素刺激组，TSP1蛋白处理组，TSP1蛋白处理+胰岛素刺激组；对于TSP基因缺失型小鼠原代肝细胞，被分为：对照组，胰岛素刺激组。用全培养基培养细胞过夜贴壁生长后，用PBS洗细胞两次，在无血清培养基中过夜处理后，在TSP1处理组中，用2ug/ml TSP1蛋白孵育细胞3h和24h，用10nm和100nm人胰岛素处理10min，在实验处理完毕之后，收集蛋白以及RNA，用来检测P-AKT，炎症因子等指标。对于脂肪酸诱导体外实验，将实验组分为：对照组，脂肪酸处理组，BSA对照组。将过夜培养贴壁细胞，更换无血清培养基，包含溶于10% BSA的200um FFA，处理细胞24h。（BSA对照组是含有与脂肪酸等体积的10%BSA）可用于油红染色，将细胞在Krebs Ringer Buffer中裂解，用试剂盒来测细胞内甘油三酯的含量，以及检测活性氧（ROS）的含量。
　　结果：
　　1.加过TSP1蛋白处理的野生型小鼠的原代肝脏细胞，相较于对照组，P-AKT的蛋白表达降低，
　　2.相较于野生型小鼠，TSP1基因的缺失使肝细胞中P-AKT的表达明显的增高。
　　3.对于脂肪酸诱导的体外实验，200um FFA处理后，相较于野生型小鼠，TSP1基因的缺失使肝细胞的甘油三脂含量明显降低。
　　结论：
　　1.TSP1基因的缺失减少了小鼠肝脏和原代肝细胞中脂滴蓄积。可能是通过脂肪酸摄取和脂肪合成减少来实现的。
　　2.TSP1基因的缺失增加了原代肝细胞对胰岛素的敏感性；减少了细胞的氧化压力，并减少了炎症因子的表达。

目录

声明

前言

1 材料、试剂和仪器

1.1 实验动物

1.2 主要试剂

1.3.主要试剂配制

1.4实验仪器

2 实验方法与步骤

2.1动物饲养和原代小鼠肝细胞的分离

2.2 蛋白的提取

2.3 BCA法测定蛋白浓度

2.4 蛋白浓度的调节

2.5 蛋白质印迹

2.6 RNA的提取

2.7细胞水平ROS定量

2.8油红O染色

2.9脂肪酸的制备

2.10统计学分析

3 结 果

3.1 TSP1基因的缺失对肝细胞脂质代谢的影响

3.2．TSP1对胰岛素敏感性的影响

4讨 论

参考文献

致谢

附录：英文缩略词（Abbreviations）

研究生期间成果