穿心莲内酯衍生物ADA诱导人乳腺癌和肺癌细胞凋亡的机制研究

摘要

肺癌已成为中国发病率最高的恶性肿瘤，而乳腺癌是女性恶性肿瘤发病率的首位。过去研究者把重点放在细胞分化与分裂方面，并没有重视细胞死亡与肿瘤发生的关联。现有研究表明细胞增殖过度是因为细胞自身清除能力下降，即本应该发生凋亡的细胞并未发生凋亡。
　　穿心莲为爵床科（Acanthaceae）植物穿心莲（Andrographis paniculata（Bum.f.）Nees）的干燥地上部分，具有清热解毒、凉血消肿之功效，在亚洲有广泛的应用，享有“苦味之王”的称号。近年来研究发现，以穿心莲内酯为代表的二萜内酯类成分具有广谱的抗肿瘤作用。本文研究了穿心莲内酯衍生物ADA对人乳腺癌MCF-7细胞和人肺A549细胞的增殖抑制作用，并通过对肿瘤细胞凋亡的影响探讨其作用机制。采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞增殖。DAPI、吖啶橙/溴乙啶（AO/EB）双染法以及Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术测定细胞凋亡。罗丹明123检测细胞线粒体膜电位变化。Western bolt法检测NF-κB信号通路相关蛋白NF-κB p65核位移、IκBɑ、磷酸化IκBɑ、磷酸化IKKβ的表达以及凋亡通路中相关蛋白Bcl-2、Bax、细胞色素C和caspase3的表达。
　　MTT结果显示，不同浓度ADA和穿心莲内酯A作用24h后，均能抑制MCF-7和A549细胞增殖。ADA对A549细胞IC50为（9.65±1.50）μM，对MCF-7细胞IC50为（6.4±3.29）μM。A对A549细胞IC50为(25.49±4.02)μM，对MCF-7细胞IC50为(19.5±2.82)μM，此数据表明ADA对于两种肿瘤细胞的增殖抑制作用显著优于先导化合物A，表明ADA比其母体A具有更强的抗乳腺癌和抗肺癌活性。
　　DAPI、AO/EB染色结果表明：与空白对照组相比ADA加药组细胞形态出现明显变化如细胞核缺失，染色质固缩，细胞边缘化等细胞凋亡特征。AO/EB染色图显示，ADA加药组与空白对照组细胞相比细胞核发出橘色荧光，EB的荧光强度随着给药浓度的增加显著增强(P＜0.01)，表明细胞出现凋亡形态特征。
　　罗丹明123（Rh123）结果表明：经过ADA作用24h后，Rh123荧光随着药物浓度的增加显著降低（P＜0.01），表明MCF-7和A549细胞线粒体膜电位降低，膜电位降低被认为是细胞凋亡发生的标志。表明肿瘤细胞因为发生凋亡而失去与罗丹明123结合的能力。
　　流式细胞术结果表明：当ADA浓度为4μM、8.5μM、10μM时，A549细胞凋亡率分别为为6.41％±2.51，9.28％±1.86，21.85％±7.75，32.46％±7.61；当ADA浓度为2μM、4μM、6μM时，MCF-7细胞凋亡率为4.34％±1.12，21.22％±2.09，32.46％±7.61，19.06％±1.23。ADA作用24h后肿瘤细胞凋亡率均显著增加(P＜0.01)，表明ADA能够诱导人乳腺癌细胞MCF-7与肺癌细胞A549凋亡。
　　Western blot实验结果表明：MCF-7和A549细胞细胞色素C被刺激释放，caspase3被激活且表达增加(P＜0.01)；促凋亡蛋白Bax的表达增加（P＜0.01），抗凋亡蛋白Bcl-2的表达降低（P＜0.05），提示ADA参与细胞色素C、Bax、Bcl-2、caspase3的调控，同时磷酸化IκBɑ、磷酸化IKKβ、细胞核内NF-κB p65表达均降低（P＜0.01)，细胞质内p65表达增加(P＜0.01)，表明ADA也参与NF-κB信号通路的调控。
　　综上所述，穿心莲内酯衍生物ADA能够抑制MCF-7细胞和A549细胞增殖诱导并促进肿瘤细胞凋亡。具体机制是通过刺激细胞色素C释放，激活caspase3，最终上调促凋亡蛋白Bax的表达，下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，最终诱导肿瘤细胞凋亡。同时， NF-κB信号的调控则是通过抑制磷酸化IKK，NF-κB抑制物IκBɑ，磷酸化IκBɑ的表达以及p65的核位移。

目录

声明

附录A:中英文缩略词表

第一章 前言

1细胞凋亡

2天然产物诱导肿瘤细胞凋亡机制研究进展

3 NF-κB信号通路

4穿心莲内酯及其衍生物诱导肿瘤细胞凋亡机制研究进展

5 立题依据

第二章 穿心莲内酯衍生物ADA对人肺癌A549细胞和人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响

1. 实验材料和仪器

2 实验方法

3实验结果

4 本章小结

第三章 穿心莲内酯衍生物ADA对人肺癌A549细胞和人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响

1. 实验材料和仪器

2实验方法

3实验结果

4 结论

第四章 穿心莲内酯衍生物ADA诱导人肺癌A549细胞和人乳腺癌凋亡机制

1 实验材料

2 实验方法

3数据处理与统计学分析

4 Western blot实验结果

5 结论

第五章 讨论

全文小结

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文及参与项目