牛冠状病毒的分离鉴定和N蛋白的表达

摘要

从腹泻犊牛粪样中分离出一株冠状病毒，该病毒可在HRT-18细胞上形成有规律的病变，对氯仿、乙醚敏感；经1％胰酶处理的病毒仍然能够在HRT-18细胞上生长，毒力保持不变；病毒分别在pH5.0和pH3.0经37℃作用2小时，pH5.0处理组毒力下降1个滴度，pH3.0处理组毒力下降2个滴度；该病毒在50℃时，毒力随时间变化而有不同程度下降，其中，50℃作用15分钟，病毒下降3个滴度；50℃作用30分钟，CPE消失；恒定时间1小时，设定50℃、60℃、70℃和80℃不同温度处理后的病毒失去增殖能力。病毒仅对HRT-18细胞敏感。提取病毒RNA后，用BcV引物RT-PCR扩增出1420bp和322bp片断，基因测序结果与USA(AF058942)株的同源性为100％，确定分离的病毒为牛冠状病毒(命名为BCV-DO)。将RT-PCR扩增出的BCV N蛋白基因与pGEM-T Easy载体连接构建BCV N蛋白克隆质粒(pGEM-T-N)，将阳性克隆质粒经BamHI与Sal I双酶切后，回收目的片段并插入到pET-32a(+)表达载体中，构建成重组质粒(pET-32a-N)，转化到Ecoli BL-21后，在37℃下，经IPTG诱导表达。用表达的重组N蛋白和分离的BCV分别免疫小鼠，用它们的抗血清分别与重组N蛋白进行Western blot。结果重组蛋白能够与重组蛋白抗血清和分离的BCV抗血清结合，表明重组蛋白能够刺激小鼠产生抗体，具有与天然BCVN蛋白相同的抗原性。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

声明

第一章综述

1.1前言

1.2牛冠状病毒性腹泻的研究进展

1.3牛冠状病毒研究进展

1.4研究目的与意义

第二章材料和方法

2.1材料

2.2方法

第三章结果

3.1 HRT-18细胞胰酶的敏感性结果

3.2病毒的分离培养结果

3.3病毒的理化学鉴定结果

3.4病毒的生物学特性鉴定结果

3.5 RT-PCR鉴定结果

3.6重组质粒PGEM-T-N的酶切鉴定结果

3.7 PCR条件的优化结果

3.8表达载体重组质粒PET-32A-N的酶切鉴定结果

3.9 BCV N蛋白基因的表达结果

3.10重组蛋白与ANTI-HIS-TAG单克隆抗体的WESTERN BLOT检测结果

3.11 IPTG诱导蛋白表达的浓度与时间条件优化结果

3.12表达蛋白纯化结果

3.13表达的N蛋白活性检测结果

3.14测序结果与分析

第四章讨论

4.1关于病毒的分离和病毒的特性

4.2 N蛋白基因的分析

4.3表达N蛋白的抗原性分析

第五章结论

参考文献

致谢

附录

作者简历