黄芩茎叶总黄酮对实验性大鼠肝纤维化的保护作用及其机制的研究

摘要

本研究采用四氯化碳(CCL4)制备大鼠肝纤维化模型，观察黄芩茎叶总黄酮(SSTF)对肝纤维化的保护作用，并对其抗肝纤维化作用机制进行探讨，为黄芩茎叶总黄酮的新药开发和应用提供确切的实验与理论依据。 研究方法： 1.CCL4致肝纤维化模型的复制雄性SD大鼠20只，随机分为模型组(12只)和对照组(8只)，模型组大鼠大腿内侧皮下注射40％CCL4色拉油溶液，0.3ml/100g体重，每周2次，共8周，复制大鼠慢性肝纤维化模型，对照组常规方法饲养。 2.SSTF对实验性大鼠肝纤维化保护作用的实验分组与指标检测： 2.1.动物分组取雄性SD大鼠60只，随机分为5组： ①正常对照组，常规方法饲养。②CCL4损伤模型组，40％CCL4色拉油溶液0.3ml/100g体重，大腿内侧皮下注射，每周2次，共8周。③CCL4损伤+SSTF低、中、高三个剂量保护组，CCL4损伤处理同②组，于第二次注射CCL4的同时灌胃(ig)给予SSTF17.5、35、70mg/kg，每天一次，连续8周。各组于造模起第8周末断头处死大鼠，留血清和肝组织标本进行指标检测。 2.2.指标检测： ①比色法测定血清谷丙转氨酶(ALT)活性和白蛋白(Alb)含量。②比色法测定肝匀浆羟脯氨酸(Hyp)含量。③比色法测定肝匀浆丙二醛(MDA)含量,超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)活性。④比色法测定肝组织总蛋白含量⑤SABC法观察肝组织a-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)的表达。⑥H.E染色和V-G胶原纤维特殊染色，光镜观察肝组织病理改变和肝纤维化程度。 研究结果： 1.血清肝功能指标的变化。CCL4慢性肝损伤后，血清ALT水平明显升高，正常组为41.25±4.90U/L，模型组为194.5±4.27U/L；Alb含量明显降低，正常组为43.05±3.21g/L，模型组为28.95±3.97g/L，与正常组比较，差异有非常显著意义(p＜0.01)。给予SSTF(17.5、35、70mg/kg)保护后，血清ALT水平明显降低，分别为174.17±5.54g/L、149.60±3.51g/L、63.52±4.10g/L，Alb含量明显升高，分别为30.11±3.03g/L、34.23±1.03g/L、40.13±4.35g/L，与模型组比较，差异有显著意义(p＜0.01，或p＜0.05)。 2.肝组织纤维化指标的变化。CCL4慢性肝损伤后，肝脏Hyp含量明显升高，正常组为58.01±3.43ug/g肝湿重，模型组为105.53±5.09ug/g肝湿重，与正常组比较，差异有非常显著意义(p＜0.01)。给予SSTF(17.5、35、70mg/kg)保护后，肝脏Hyp含量降低，分别为98.20±4.05ug/g肝湿重、80.71±4.23ug/g肝湿重、62.84±3.46ug/g肝湿重，与模型组比较，差异有显著意义(p＜0.01，或p＜0.05)。 3.肝组织中MDA含量及SOD、GSH-px活性的变化。CCL4慢性肝损伤后，模型组大鼠肝组织MDA含量显著升高，正常组为21.47±4.12nmol/mg蛋白，模型组为37.50±2.25nmol/mg蛋白；SOD活性显著降低，正常组为142.70±5.56NU/mg蛋白，模型组为92.24±5.90NU/mg蛋白；GSH-px活性显著降低，正常组为70.61±4.88U/mg蛋白，模型组为20.06±4.10U/mg蛋白；与正常组比较差异有非常显著意义(p＜0.01)。给予SSTF(17.5、35、70mg/kg)保护后，MDA含量明显降低，分别为34.31±4.67nmol/mg蛋白、30.12±3.55nmol/mg蛋白、23.74±4.77nmol/mg蛋白；SOD活性明显升高，分别为119.12±4.19NU/mg蛋白、124.45±4.63NU/mg蛋白、145.31±4.01NU/mg蛋白；GSH-px活性明显升高，分别为34.92±5.01U/mg蛋白、45.88±5.05U/mg蛋白、62.79±4.28U/mg蛋白；与模型组比较，差异有显著意义(p＜0.01，或p＜0.05)，且具有明显的剂量依从性。 4.肝组织a-SMA表达的变化。 免疫组化结果显示：对照组肝组织内a-SMA主要表达于汇管区动、静脉壁，模型组a-SMA在汇管区、纤维间隔及炎症细胞浸润区均呈阳性表达，SSTF各保护组a-SMA表达较模型组有明显的减弱，仅在汇管区有少量表达。5形态学观察： 肝组织病理切片H.E染色和V-G胶原纤维特殊染色光镜下观察结果显示：模型组表现为慢性肝纤维化改变，肝细胞肿胀变性，肝内有大量纤维组织增生，交联呈网状结构，胶原纤维染色呈强阳性，分布与纤维间隔一致，给予SSTF保护后，肝组织病理改变明显好转，只有轻度空泡样和脂肪样变性，肝纤维组织增生明显减少，于肝窦和汇管区可见轻度增生的胶原和网状纤维，纤维隔基本消失。 上述各项结果充分显示：1.CCL4慢性肝损伤后，血清ALT活性明显升高，Alb含量明显降低，肝脏Hyp含量明显升高，a-SMA阳性表达，肝组织有明显的病理改变，表明CCL4大鼠肝纤维化模型复制成功。2.大鼠慢性肝损伤后给予SSTF不同剂量保护，均可使血清ALT活性明显降低，Alb含量明显升高，肝脏Hyp含量明显降低，a-SMA表达量明显减少，且肝组织病理改变明显好转，提示SSTF对CCL4诱导的肝纤维化有很好的保护作用；3.SSTF能降低损伤组肝组织MDA含量，提高SOD、GSH-px活性，随着SOD、GSH-px活性的提高，血清生化指标、肝纤维化指标、肝组织病理改变和纤维组织增生均有明显改善，肝组织内a-SMA表达量明显减少。充分表明SSTF具有较强的抗氧化作用，且对肝纤维化的保护作用与抗氧化作用密切相关。 研究结论： 1.SSTF能明显改善肝功能，减少肝组织炎症反应，抑制胶原纤维在肝内的增生和沉积。表明SSTF对大鼠肝纤维化有较强的保护作用。 2.SSTF能够提高内源性抗氧化酶SOD、GSH-px的活性，降低脂质过氧化产物MDA的含量，具有较强的清除自由基的抗氧化作用，通过抑制氧化应激对肝星形细胞的活化，有效阻止了胶原蛋白等细胞外基质在肝内的大量增生和广泛沉积，逆转了肝纤维化的发生和发展，这就是SSTF对肝纤维化有较强保护作用的重要机制之一。 3.CCL4诱导肝纤维化是经典肝毒模型，其病理过程与人类多种原因导致的肝纤维化的病理过程相类似，因此，该模型可用来研究、筛选保肝护肝的中药新药。

目录

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 中药抗肝纤维化分子机制的研究概况

致谢

个人简历