实验动物皮肤病原真菌分子生物学检测方法的建立及应用

摘要

目的：大鼠、小鼠、豚鼠、家兔等作为实验动物，已广泛应用于科研、教学和生产实践中。三种致病性皮肤真菌：犬小孢子菌、石膏样小孢子菌、须毛癣菌，是所有实验动物应排除的病原菌，不论是从动物皮肤病灶处或从非病灶处分离到这三种菌，均视为异常。因为非病灶处的真菌很可能随后引起实验动物的皮肤病，并有可能造成饲养和实验人员的感染。 目前该病的实验室诊断主要依赖于形态学观察(直接镜检及真菌培养)，但所需时间长，且不易鉴定到种的水平，尤其需要较长的工作经验，因而不能满足实验动物快速、准确检测的需要。近年来，分子生物学方法开始应用于真菌学研究方面，如RFLP、分子杂交、DNA序列分析等，特别是任意引物聚合酶链式反应(AP-PCR)，有力地促进了皮肤病原真菌检测的发展。本研究将皮肤病原真菌通用引物PCR与AP-PCR技术相结合，应用于实验动物皮肤病原真菌的检测，使真菌的表型鉴定转向基因型鉴定，以达到快速准确检测实验动物皮肤病原真菌的目的。 方法： 1.标准菌株的DNA提取及PCR扩增：取标准菌株犬小孢子菌、石膏样小孢子菌、须毛癣菌传种至沙氏斜面固体培养基，27℃培养7天。无菌条件下各取少量以上三种培养物，接种于沙氏液体培养基，置27℃恒温摇床80转/分振荡培养10天。将培养液倒入100ml离心管内离心，沉淀装入1.5mlEp管中，-70℃或液氮保存。取以上冷冻保存的三种菌沉淀物少量(各约10mg)用破壁酶破壁，使用酚氯仿抽提法抽提DNA；然后用皮肤病原真菌通用引物(CHS11S，CHS11R)和随机引物(FM1)进行PCR扩增，鉴别三种皮肤真菌标准菌株。 2.通用引物PCR特异性及敏感性测定特异性测定：用皮肤病原真菌通用引物进行PCR，扩增大肠杆菌DNA(化学裂解法提取)、犬肝炎病毒DNA及小鼠肝癌H22细胞DNA(由本室提供)。 敏感性测定：DNA提取方法同上，以紫外分光光度法测定DNA质量浓度，根据测定值将DNA进行10倍系列质量浓度稀释，得到100ng-10fg的8个质量浓度，然后对其进行PCR扩增。 3.皮肤病原真菌动物模型的建立：取三种标准菌株传种到沙氏斜面固体培养基，27℃培养10天。取下菌落加适量灭菌生理盐水制成菌悬液，用划痕法建立实验动物皮肤病原真菌动物模型。 4.使用分子生物学方法及传统方法检测皮肤病原真菌：用接种铲从建立的动物模型身上刮取毛发及鳞屑于沙氏斜面固体培养基上培养，2～3天后菌落长出，从培养基上刮取菌落提取DNA及用通用引物PCR扩增鉴别，同时将可疑菌落分离纯化，6～7天后用随机引物FM1进行PCR扩增鉴别，12～14天后根据镜检及菌落形态鉴别皮肤病原真菌。 5.河北省各地实验动物的皮肤病原真菌检测：从实验动物身上刮取毛发及鳞屑于沙氏斜面固体培养基上培养，待菌落长出后，从培养基上刮取菌落提取DNA及用通用引物PCR扩增鉴别，同时将可疑菌落分离纯化，6～7天后用随机引物FM1进行PCR扩增鉴别，12～14天后根据镜检及菌落形态鉴别皮肤病原真菌。 结论: 1.皮肤病原真菌通用引物(CHS11S，CHS11R)具有较强的特异性。将皮肤病原真菌通用引物PCR与AP-PCR技术相结合，可快速、准确鉴别实验动物皮肤病原真菌。 2.实验验证皮肤病原真菌通用引物PCR检测敏感度为100fg。 3.通过“划痕法”，使用经过固体培养基的培养、保藏和液体培养基的传代的标准菌株，仍能比较容易的制备出皮肤病原真菌动物模型。 4.分子生物学方法与传统方法相比具有快速、敏感、特异性强的优点，经过进一步验证认为可替代传统的实验动物皮肤病原真菌检测方法。

目录

摘要

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述皮肤癣菌分类及诊断的分子生物学研究进展

致谢

个人简历