苦参碱和氧化苦参碱防治增殖性玻璃体视网膜病变的实验研究

摘要

增殖性玻璃体视网膜病变(proliferativevitreoretinopathy，PVR)是一种严重损害视功能的常见致盲性眼病，也是孔源性视网膜脱离复位手术失败的主要原因。目前，在临床上对于PVR的治疗主要实行玻璃体切除手术，但是手术的并发症较多，难以挽救受到严重损害的视功能，而且玻璃体切除术本身也是PVR的常见诱因。尽管已经开展了多方面的研究工作，现在还没有其它的PVR防治策略，药物防治PVR的发生发展就成为最实用也最有前途的方法。因此，国内外许多学者一直在努力寻求能够抑制视网膜色素上皮细胞(retinalpigmentepithelialcells，RPE细胞)的扩散和增殖，从而防治PVR的药物进行辅助治疗。然而，由于受到血-眼屏障、血浆蛋白结合、全身用药眼内药物分布浓度较低、半衰期较短和眼内应用毒副作用较大等多种因素的影响，到目前为止尚无临床可用的安全有效的PVR防治药物。苦参碱和氧化苦参碱是近些年来分离提取的中药单体成分，具有突出的抗纤维化作用，已知的药理活性可以在多方面满足PVR防治药物的条件。本研究课题旨在对苦参碱和氧化苦参碱防治PVR发生发展的潜在可能性进行研究探讨。 第一部分苦参碱和氧化苦参碱对视网膜色素上皮细胞增殖抑制的体外实验研究 目的:增殖性玻璃体视网膜病变(PVR)是一种眼内细胞过度增生的修复反应，RPE细胞既是增殖的始发细胞，也是最重要的增殖细胞，对RPE细胞的增殖进行抑制就可能有效防治PVR。本部分观察了苦参碱和氧化苦参碱对体外培养RPE细胞增殖的抑制作用，旨在探讨苦参碱和氧化苦参碱在PVR防治中的潜在价值。 方法:采用酶分解的方法从有色兔眼的视网膜获取RPE细胞，应用10％FBS-DMEM进行细胞培养，记录细胞生长曲线，并且应用免疫组化方法进行鉴定。选取生长状态良好的第4代RPE细胞，以2×104细胞/ml密度接种于96孔培养板，每孔200μl，在同步化培养后，分为苦参碱组、氧化苦参碱组、苏拉明组和对照组，每种药物浓度各设5个复孔，另设5个复孔为空白对照孔，共接种5块培养板。在加药培养24h、48h、72h、96h或120h各取1块培养板，应用MTT比色法测定每孔的吸光度值，各药物浓度组与对照组比较计算出增殖抑制率，求得各药在加药培养72h的半数抑制率(IC50)剂量，并对各个药物浓度组在不同作用时间的增殖抑制率进行方差分析比较。另外选取生长状态良好的第4代RPE细胞，以1×106细胞/ml密度接种于100ml塑料培养瓶共4瓶，每瓶600μl，在对照组加入10％FBS-DMEM8ml，苦参碱、氧化苦参碱和苏拉明组分别加入10％FBS-DMEM配制的相应药物溶液8ml，药物浓度均为150μg/ml。细胞加药培养72h，随时观察细胞形态和数量的变化。培养结束后，应用血细胞计数板计数各组细胞的数量，应用流式细胞仪检测各组的细胞周期比例，进行统计学分析。 结论:苦参碱、氧化苦参碱和苏拉明对体外血清诱导的RPE细胞的增殖均有抑制作用，均呈剂量和时间依赖性，抑制作用的强度苦参碱＞氧化苦参碱＞苏拉明。苦参碱和氧化苦参碱可以将RPE细胞的增殖阻滞在S期，苏拉明可以将RPE细胞的增殖阻滞在G2-M期。 第二部分苦参碱和氧化苦参碱玻璃体内注射后眼内毒副作用的实验研究 目的:药物的毒副作用明显地制约着药物能否在临床上应用。尽管苦参碱和氧化苦参碱已经有临床可用的药品销售，并且证实了其全身应用的安全性，但是在玻璃体内注射给药的安全性问题仍然需要足够的重视。因此，本部分针对苦参碱和氧化苦参碱在玻璃体内注射后的眼内毒副作用进行了研究探讨。 方法:健康成年新西兰大耳白兔36只随机分为苦参碱和氧化苦参碱两组，每组18只。随机选取每只兔子的右眼或左眼为实验眼，玻璃体内注射0.01ml不同剂量(1mg，2mg或4mg)的苦参碱或氧化苦参碱生理盐水溶液，每种药物剂量组各有6只眼；对侧眼为对照眼，在玻璃体内注射0.01ml的生理盐水。在玻璃体内注射前1d和注射后即时、24h、3d、7d和14d，通过裂隙灯显微镜、间接检眼镜、视网膜电图(ERG)等检查方法评价药物的眼内毒副作用，并且在注射后3d、7d和14d从每种药物剂量组各取已经完成ERG检查的2只实验用兔，摘除双眼眼球，进行视网膜光学显微镜和透射电子显微镜检查。 结论:苦参碱和氧化苦参碱玻璃体内注射是相对安全的，2mg以下是玻璃体内注射的安全剂量范围。苦参碱和氧化苦参碱在玻璃体内注射的主要毒副作用是对RPE细胞的损害，苦参碱的作用略强于氧化苦参碱。 第三部分苦参碱和氧化苦参碱玻璃体内注射后眼内药代动力学的实验研究 目的:增殖性玻璃体视网膜病变(PVR)的发生发展是一个缓慢的动态过程，在玻璃体内注射药物是防治PVR发生发展的首选给药方式，这就要求其防治药物在玻璃体内注射后能够较长时间地维持有效浓度。因此，本部分针对苦参碱和氧化苦参碱在玻璃体内注射后的眼内药代动力学过程进行了研究探讨。 方法:健康成年新西兰大耳白兔60只随机分为标准及质控组6只，苦参碱组和氧化苦参碱组各为27只。苦参碱和氧化苦参碱组分别随机地再分9组(每组3兔6眼)，在玻璃体内注射1.5mg/0.01ml苦参碱或氧化苦参碱生理盐水溶液后15min、8h、16h、24h、36h、48h、60h、72h和96h，将相应组别的实验用兔按照组内手术先后顺序依次摘除眼球，制备玻璃体待检样品，并且应用高效液相色谱技术检测药物浓度。同时，针对玻璃体样品制备和利用高效液相色谱技术检测玻璃体样品的方法学进行研究。 结果:按照本研究采用的玻璃体样品的处理和检测方法，苦参碱和氧化苦参碱的保留时间分别为8.9min和10.5min。此种方法检测苦参碱和氧化苦参碱在玻璃体内的浓度具有很好的特异性，没有其它内源性物质和相应代谢物的干扰。检测方法的准确度和精密度较高，并且苦参碱和氧化苦参碱的提取回收率均大于85％。在1.5mg/0.01ml苦参碱或氧化苦参碱生理盐水溶液注入玻璃体内15min后测得的质量浓度分别为(1185.04±67.98)μg/ml和(1174.85±53.29)μg/ml。在注射后8h、16h、24h、48h、72h和96h，苦参碱组分别排出总量的24.64％、41.25％、55.56％、88.95％、98.26％和99.68％；氧化苦参碱组分别排出总量的22.92％、34.51％、47.25％、85.74％、97.22％和99.53％。苦参碱组和氧化苦参碱组相比较，在以上各时间点的药物代谢率没有显著性差异(P＞0.05)。1.5mg/0.01ml苦参碱或氧化苦参碱生理盐水溶液在玻璃体内注射后的半衰期，苦参碱组为11.61h，氧化苦参碱组为12.53h。 结论:1.5mg/0.01ml苦参碱或氧化苦参碱生理盐水溶液在玻璃体内注射后的有效质量浓度时间相对较长，其药代动力学过程早期为零级动力学代谢，晚期为一级动力学代谢。 第四部分苦参碱和氧化苦参碱防治增殖性玻璃体视网膜病变的体内实验研究 目的:增殖性玻璃体视网膜病变(PVR)是在一个复杂的多因素系统中发生发展的，体外的研究结果可能受到体内多种其它因素的限制，从而影响药物在体内的治疗效果。因此，本部分针对苦参碱和氧化苦参碱在体内防治实验性PVR的效果进行了研究探讨。 方法:健康成年有色兔30只被随机地分为对照组、苏拉明组、氧化苦参碱组、苦参碱组、中期给药组和后期给药组，每组5兔10眼。所有实验用兔的双眼均在玻璃体中央注射0.1mlRPE细胞悬液(1×106细胞/ml)诱导实验性PVR模型。RPE细胞悬液被注射后，随即在苏拉明、苦参碱和氧化苦参碱组的兔眼玻璃体内分别注射1.5mg/0.01ml相应药品的生理盐水溶液，并在对照组兔眼玻璃体内注射0.01ml生理盐水。中期给药组和后期给药组则分别在细胞注射后3d和10d时，在玻璃体内注射1.5mg/0.01ml苦参碱生理盐水溶液。所有实验用兔的双眼在细胞注射后1d、3d、5d、10d、14d、21d和28d，通过裂隙灯显微镜、间接检眼镜、眼底彩色照相机和B型超声诊断仪等详细观察记录角膜、房水、晶状体、玻璃体和眼底情况，特别注意观察玻璃体视网膜出现的变化。 结论:苦参碱、氧化苦参碱和苏拉明玻璃体内注射后，对RPE细胞诱导的实验性PVR的发生发展均有抑制作用，其中以苦参碱的抑制作用最强。苦参碱和氧化苦参碱在PVR形成的炎症期和增殖期均有抑制作用，在炎症期的作用更为明显。 综合上述四部分研究结果：苦参碱和氧化苦参碱可以在体外抑制RPE细胞的增殖，在玻璃体内注射的毒副作用较小，维持有效质量浓度的时间相对较长，并且可以在体内抑制实验性PVR的发生发展。因此得出结论：苦参碱和氧化苦参碱可以成为PVR安全有效的防治药物，值得进一步研究、开发和利用。

目录

摘要

英文缩写

引言

第一部分苦参碱和氧化苦参碱对视网膜色素上皮细胞增殖抑制的体外实验研究

第二部分苦参碱和氧化苦参碱玻璃体内注射后眼内毒副作用的实验研究

第三部分苦参碱和氧化苦参碱玻璃体内注射后眼内药代动力学的实验研究

第四部分苦参碱和氧化苦参碱防治增殖性玻璃体视网膜病变的体内实验研究

结论

综述

致谢

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