川芎嗪抗脑缺血损伤及增强脑缺血耐受的作用和机制研究

摘要

目的：通过动物实验证实川芎嗪(tetramethylpyrazine，TMP)具有抗脑缺血损伤以及增强CIP(脑预缺血，cerebralischemic preconditioning)脑保护效果、促进脑缺血耐受形成的作用，并从调节脑组织NO含量、NOS活性和调控凋亡相关基因Bax、bcl-2蛋白表达等角度，初步探讨其作用机制，进一步为临床使用TMP预防和治疗脑缺血性疾病提供实验依据。 方法: 第一部分川芎嗪抗脑缺血损伤及CIP脑保护作用的实验研究。将96只健康昆明小鼠随机分为4组：假手术组、缺血损伤组、BFT模型组、TMP预防组。每组n=24。TMP预防组用川芎嗪按40mg/Kg/d腹腔注射，连续3d，假手术组、缺血损伤组、BIT模型组腹腔注射等量生理盐水。第一次腹腔注射30min后所有小鼠经10％水合氯醛0.33ml/100g腹腔麻醉，仰卧固定于手术台上，颈前正中开口，钝性分离双侧颈总动脉。BIT模型组用微动脉夹夹闭双侧颈总动脉6 min作为预处理，然后恢复灌流。假手术组、缺血损伤组和TMP预防组只暴露双侧颈总动脉6 min，不阻断血流。最后一次腹腔注射30min后，所有小鼠经乙醚吸入麻醉，暴露双侧颈总动脉，缺血损伤组、BIT模型组、TMP预防组均阻断血流20 min，然后恢复灌流，假手术组只暴露颈总动脉20min，不阻断血流；术中及术后注意保暖，正常饮食。术后24h从各组随机选取12只小鼠断头处死，迅速剥取全脑，左侧半球低温保存，采用生化方法检测脑组织NOS活性和NO含量；右侧半球用4％多聚甲醛溶液固定，常规石蜡切片，采用免疫组化方法检测海马组织Bax和bcl-2蛋白表达。其余小鼠于术后7d全部处死，迅速剥取全脑，冠状切取视交叉后1至4mm脑片，多聚甲醛固定，常规石蜡切片，HE染色，光镜下观察海马CAl区组织学分级和神经元密度(neuronaldensity，ND)。 第二部分川芎嗪增强脑缺血耐受的作用和机制研究。将96只健康昆明小鼠随机分为4组：假手术组、缺血损伤组、BIT模型组、TMP干预组，每组n=24。TMP干预组用川芎嗪按40mg/Kg/d腹腔注射，连续3d，假手术组、缺血损伤组腹腔注射等量生理盐水。第一次腹腔注射30min后所有小鼠经10％水合氯醛0.33ml/100g腹腔麻醉，仰卧固定于手术台上，颈前正中开口，钝性分离双侧颈总动脉。BIT模型组、TMP干预组用微动脉夹夹闭双侧颈总动脉6 min作为预处理，然后恢复灌流。假手术组、缺血损伤组只暴露双侧颈总动脉6 min，不阻断血流。最后一次腹腔注射30min后，所有小鼠经乙醚吸入麻醉，暴露双侧颈总动脉，缺血损伤组、BIT模型组、TMP干预组均阻断血流40 min，然后恢复灌流，假手术组只暴露颈总动脉40min，不阻断血流；术中及术后注意保暖，正常饮食。术后24h从各组随机选取12只小鼠断头处死，迅速剥取全脑，左侧半球低温保存，采用生化方法检测脑组织NOS活性和NO含量；右侧半球用4％。 多聚甲醛溶液固定，常规石蜡切片，采用免疫组化方法检测海马组织Bax和bcl-2蛋白表达。其余小鼠于术后7d全部处死，迅速剥取全脑，冠状切取视交叉后1至4mm脑片，多聚甲醛固定，常规石蜡切片，HE染色，光镜下观察海马CA1区组织学分级和神经元密度(neuronal density，ND)。 结果:第一部分川芎嗪抗脑缺血损伤及CIP脑保护作用的实验研究。 1. 术后7d海马CA1区组织病理学改变光镜观察发现，假手术组海马CA1区无明显组织学损伤，组织学分级多为0级和1级。缺血损伤组海马CA1区组织学损伤明显，主要表现为锥体细胞缺失较多，残留的锥体细胞排列松散不规则，多数锥体细胞胞核固缩，组织学分级多为2级和3级，与假手术组相比有显著性差异(P<0.01)。BIT模型组海马CA1区组织学损伤轻微，组织学分级多为1级，与缺血损伤组相比差异显著(P<0.01)。TMP预防组CA1区组织学损伤亦较轻微，组织学分级多为1级，与缺血损伤组相比差异显著(P<0.05)。两者比假手术组损伤严重，相比差异显著(P<0.05)。 通过计算海马CA1区神经元密度得知，假手术组(ND=214±17n/mm)和缺血损伤组(ND=74±9 n/mm)相比差异显著(P<0.01)，BIT模型组(ND=158±18n/mm)和TMP预防组(ND=153±19n/mm)神经元密度均明显高于缺血损伤组(P<0.01)，而两者又明显低于假手术组(P<0.01)。 2. 术后24h脑组织NOS活性和NO含量变化缺血损伤组小鼠脑组织NOS活性(40.72±4.03U/gprot)与假手术组(17.01±4.96 U/gprot)相比明显升高(P<0.01)，BIT模型组(31.56±2.48 U/gprot)和TMP预防组(31.08±2.38 U/gprot)NOS活性较缺血组明显降低(P<0.01)，而较假手术组又明显升高(P<0.01)。 NO含量缺血损伤组(1.42±0.11μmol/gprot)与假手术组(0.71±0.14μmol/gprot)相比明显升高(P<0.01)，BIT模型组(1.08±0.10μmol/gprot)和TMP预防组(1.03±0.09μmol/gprot)较缺血损伤组明显降低(P<0.01)，而较假手术组又明显升高(P<0.01)。 3. 术后24h海马CA1区Bax和bcl-2蛋白表达变化假手术组Bax表达以±为主，bcl-2亦未见明显表达。与假手术组相比，缺血损伤组Bax表达明显增多，以++为主(P<0.01)，bcl-2表达亦见增多，但无统计学意义(P>0.05)。与缺血损伤组相比，BIT模型组、TMP预防组Bax表达明显减少(P<0.01)，以+为主，bcl-2表达明显增多(P<0.01)。以++为主。两者与假手术组比较Bax、bcl-2均有明显差异(P<0.01)。 第二部分川芎嗪增强脑缺血耐受的作用和机制研究。 1. 术后7d海马CA1区组织病理学改变假手术组海马CA1区无明显组织学损伤，组织学分级多为0级和1级，神经元密度ND=214+17 n/mm；缺血损伤组海马CA1区损伤明显，组织学分级多为2级和3级，神经元密度ND=58±14n/mm，两组相比有显著性差异(P<0.01)。BIT模型组海马CA1区损伤亦明显，组织学分级多为2级和3级，神经元密度ND=60±15n/mm，与缺血损伤组比较无统计学意义。TMP干预组海马CA1区组织学分级多为1级和2级，明显低于缺血损伤组和BIT模型组(P<0.01)，而神经元密度(ND=111±13n/mm)明显高于缺血损伤组和BIT模型组(P<0.01)。但和假手术组相比损伤依然明显(P<0.01)。 2. 术后24h脑组织NOS活性和NO含量变化缺血损伤组小鼠脑组织NOS活性(51.72±7.07U/gprot)、NO含量(1.78±0.21μmol/gprot)和BIT模型组NOS活性(50.45±6.18 U/gprot)、NO含量(1.69±0.12/μmol/gprot)与假手术组NOS活性(17.01±4.96 U/gprot)和NO含量(0.71±0.14μmol/gprot)相比明显升高(P<0.01)，但两者之间无差别。TMP干预组NOS活性(34.74±4.18 U/gprot)、NO含量(1.33±0.11μmol/gprot)较缺血组、BIT模型组明显降低(P<0.01)，而较假手术组又明显升高(P<0.01)。 3. 术后24h海马CAl区Bax和bcl-2蛋白表达变化与假手术组相比，缺血损伤组、BIT模型组Bax、bcl-2表达明显增多(P<0.01)，而两者之间无差异。TMP干预组较缺血损伤组、BIT模型组Bax表达明显减弱(P<0.05)、bcl-2表达明显增强(P<0.05)。而较假手术组Bax、bcl-2表达明显增强(P<0.01)。 结论: 1. 通过夹闭双颈总动脉导致昆明小鼠前脑缺血20min，可引起明显的海马组织损伤，脑缺血40min可使海马组织损伤有加重趋势，而川芎嗪对脑缺血引起的小鼠海马组织损伤具有明显的保护作用。 2. 川芎嗪能够明显降低缺血脑组织NO含量和NOS活性，从而抑制其神经毒性作用，减轻脑损伤；同时，川芎嗪能够明显增强海马CA1区bcl-2蛋白表达，降低Bax蛋白表达，上调bcl-2/Bax比例，从而抑制细胞凋亡，减轻脑缺血引起的海马神经元损伤。这可能是本方抗脑缺血损伤的重要机制之一。 3. 以6min脑缺血作为预处理(CIP)，可对间隔2d后20min脑缺血引起的海马神经元损伤产生一定的保护作用。但是，6min CIP的脑保护作用是有限的，对后续40min脑缺血引起的海马神经元损伤几乎不产生保护，而川芎嗪能够对CIP产生良性干预效应，增强其脑保护作用，促进脑缺血耐受形成。 4 .在CIP诱导BIT形成过程中，通过川芎嗪的干预，能够使缺血脑组织NOS活性进一步下降，NO含量进一步降低，bcl-2蛋白表达进一步增多，Bax蛋白表达进一步减少，这可能是其提高CIP脑保护效果，增强脑缺血耐受的重要机制之

目录

论文说明：英文缩写

摘要

引言

第一部分川芎嗪抗脑缺血损伤及CIP脑保护作用的实验研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分川芎嗪增强脑缺血耐受的作用及机制研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述中药川芎及其有效组分抗脑缺血损伤的实验研究进展

致谢

个人简历