河北省汉坦病毒的分离及其代表毒株S片段全基因序列分析

摘要

目的：以河北省肾综合征出血热疫区汉坦病毒抗原阳性的鼠肺标本为研究对象，分离汉坦病毒，进行型别鉴定，对所分离病毒全S基因片段核苷酸序列进行分析，阐明河北省疫区汉坦病毒型别和基因特征，指导本病诊断、预防和控制。 方法： 1 IFA法对鼠肺标本进行初筛，免疫荧光阳性者采取细胞培养的方法分离病毒。 2 复苏既往保存的病毒毒株。 3 提取病毒RNA后采用反转录套式PCR进行基因分型。 4 Rr-PCR．法扩增全S基因片段，产物纯化后经TA克隆连接入pMD19-T质粒载体，转化入JM109感受态细菌。 5 筛选阳性重组质粒，提取后测序，用分子进化方法和软件分析病毒核苷酸和氨基酸的同源性，并绘制系统进化树。 结果： 1 4份阳性鼠肺标本的组织悬液接种Vero-E6细胞3～4代后，经IFA检测细胞内出现病毒特异性荧光颗粒，未发现致细胞病变效应(CPE)。 2 4份标本全部分离成功，得到4株汉坦病毒分别命名为06HBB34、06HBB38、06tHBC78和06HBC79。 3 取既往保存毒株纯化病毒上清或-70℃保存的毒液上清接种Vero-E6细胞1～2代后，经IFA检测细胞内出现较强的病毒特异性荧光颗粒，6株毒株全部复苏成功。 4 将1O株病毒应用特异分型引物进行基因分型，显示lO株病毒均属于SEO型汉坦病毒。 5 成功构建了含93HBX12病毒毒株全S基因片段的重组质粒。核苷酸测序结果为：S基因片段全长1772 nt，其中A、T、C、G的比例分别为31.72％、23.02％、25.96％、19.30％。A+T的含量为57.67％，C+G的含量为42.33％。由5’非编码区、开放阅读框以及3’非编码区三部分组成。5’和3’非编码区的长度分别为42nt、440nt。只存在一个全长为1290nt的完整开放阅读框，编码N蛋白429个氨基酸。与其他汉坦病毒一样，93HBXl2株S片段的RNA其3’和5’末端反向互补，形成锅柄状二级结构。 6 将93HBX12病毒株与其他汉坦病毒株的S基因片段核苷酸序列进行比较，显示93HBXl2株S基因片段核苷酸序列与SEO型的同源性最高(96.3％～97.8％)，其次是HTN型(73.4％～74.5％)和DOB型(73.7％)；氨基酸同源性与SEO型为97.9％～99.3％，与HTN型为71.8％～82.8％，与DOB型为80.4％；与PUU型和南北美洲的致HPS病毒(TULA、SN、PH、BAY、BCC、ORN、AND)相比无论是核苷酸序列还是氨基酸序列同源性均相差甚远。 7 汉坦病毒全S基因片段核苷酸序列系统发生树显示，汉坦病毒主要形成分别同鼠亚科、田鼠亚科、棉鼠亚科啮齿类宿主动物相关的三大分支。93HBX12病毒株的位置在以鼠亚科的褐家鼠为主要宿主动物的SEO型HV位置，与所有的毒株中亲缘关系较近的是BiHDOl、ZT71和80-39株。S片段编码区推导的氨基酸序列系统发生树显示，93HBX12病毒株编码核蛋白的氨基酸序列仍与SEO型HV亲缘关系最相近。 结论： 1 河北省HV以SEO型为主，并在全省广泛分布。 2 SEO型汉坦病毒分离虽无明显细胞病变，但只要方法得当，提高SEO型汉坦病毒的分离率是能够实现的。 3 只要保存得当，汉坦病毒毒株可在．70℃保存十几年以上。 4 在中国，东方田鼠可以作为SEO型汉坦病毒的一个选择性宿主，尚未发现它可携带}[PS型汉坦病毒。 5 93HBX12病毒株S基因片段核苷酸序列与SEO型HV具有较好的同源性，S片段克隆不仅可用于SEO型HV的诊断，也可作为HIN型HV的诊断性抗原。

目录

摘要

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 汉坦病毒基因变异的研究进展

致谢

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