阳和汤大鼠含药血清对人肺癌GLC-82细胞作用及作用机制的实验研究

摘要

目的：探讨阳和汤大鼠含药血清对人肺癌GLC-82细胞作用及其作用机制，为临床应用阳和汤治疗肺癌提供理论依据。同时也为中医温阳法抗癌提供理论依据。 方法：本研究分为生理盐水对照组、阳和汤组(姜炭2g、鹿角胶9g、肉桂3g、熟地30g、白芥子6g、生甘草3g、麻黄2g)、阳和汤热药组(姜炭2g、鹿角胶9g、肉桂3g)、阳和汤非热药组(白芥子6g、生甘草3g、麻黄2g、熟地30g)，三个中药组以低、中、高剂量各分为三组，共10组。用低、中、高剂量的阳和汤、阳和汤热药、阳和汤非热药水煎剂分别给SD大鼠灌胃，制备低、中、高剂量阳和汤、热药、非热药含药血清；并用相同的方法同时制备生理盐水对照血清。以上述血清分别作用于人肺腺癌GLC-82细胞：采用MTI、法观察阳和汤含药血清、热药含药血清、非热药含药血清在24h、48h、72h对GLC-82细胞生长的抑制作用，流式细胞术检测上述含药血清在48h时对GLC-82细胞周期的变化和凋亡的影响。光镜下观察上述血清作用前后GLC-82细胞的形态学变化。应用细胞免疫化学法检测上述血清作用于GLC-82细胞后凋亡相关蛋白bcl-2的表达情况。 结果：1阳和汤高剂量血清组的吸光度值在48h和72h时低于对照组血清，并且有显著统计学意义(P<0.01)；同时可以看到其作用24h、48h、72h的生长抑制率分别为-1.1％、45.2％、74.6％，并且随着作用时间延长，其吸光度逐渐降低，抑制率逐渐增高。阳和汤热药高剂量血清组在48h和72h时的吸光度值低于对照血清组，有显著统计学意义(P<0.01)；同时可以看到阳和汤热药高剂量血清组24h、48h、72h时生长抑制率分别为-0.4％、36.4％、59.8％，并随着作用时间的延长，其吸光度值逐渐降低，抑制率逐渐增高。阳和汤非热药高剂量组的吸光度在72h时低于对照血清组，有显著统计学意义(P<0.01)；同时可以看到其在24h、48h、72h生长抑制率分别为-1.8％、0.8％、9.3％，并且随着作用时间的延长，其吸光度并不逐渐降低，而抑制率逐渐增高。阳和汤高剂量血清组抑制率在48h、72h高于相对应的热药组高剂量血清组和非热药高剂量血清组，有显著统计学差异 (P<0.01)；高剂量热药血清组抑制率在48h、72h高于相对应的高剂量非热药血清组，并有统计学意义 (P<0.01)。其他药物血清组与对照血清组的吸光度值之间没有统计学意义。2低、中、高剂量阳和汤血清组的S期细胞所占比例在作用48h时均低于对照血清组，有显著统计学意义(P<0.01)；其中中、高剂量阳和汤血清组的G0/G1期所占比例均高于对照血清组，有显著统计学意义(P<0.01)。低、中、高剂量阳和汤热药血清组的S期细胞所占比例在作用48h时均低于对照血清组，有显著统计学意义(P<0.01)，而三组的G0/G1期所占比例均高于对照血清组，有显著统计学意义(P<0.01)。阳和汤非热药高剂量血清组的S期细胞所占比例在作用48h时低于对照血清组，有显著统计学意义(P<0.01)，同时低、中、高剂量阳和汤非热药血清组的G0/G1期所占比例均高于对照血清组，有显著统计学意义(P<0.01)。中剂量阳和汤组S期细胞所占比例低于中剂量热药组和中剂量非热药组，并且有显著统计学意义(P<0.01)；中剂量阳和汤热药组 S 期细胞所占比例低于中剂量非热药组，并且有显著统计学意义(P<0.01)；高剂量阳和汤组G0/G1期所占比例要高于高剂量热药组和高剂量非热药组，并有统计学意义(P<0.01)。提示阳和汤、阳和汤热药、阳和汤非热药均有阻滞细胞周期作用，但是差异不明显。3阳和汤中、高剂量血清的凋亡率在作用48h时分别为24.64％、28.76％，均高于对照血清组，有显著统计学意义(P<0.01)；并且随着剂量的增高凋亡率逐渐增大，有统计学意义(P<0.05)。阳和汤热药中、高剂量血清的凋亡率在含药血清作用48h时分别为18.57％、23.6％，均高于对照血清组，有显著统计学意义(P<0.01.)；并且随着剂量的增高凋亡率逐渐增大，有统计学意义(P<0.05)。其它中药血清组与对照血清组之间的凋亡率差异无统计学意义 (P>0.05)。阳和汤中、高剂量血清组的凋亡率高于相对应的阳和汤热药中、高剂量血清组和阳和汤非热药中、高剂量血清组，有统计学意义(P<0.05)。阳和汤热药中、高剂量血清组的凋亡率高于相对应的阳和汤非热药中、高剂量血清组，有显著统计学意义(P<0.01)。4倒置显微镜观察，可见高剂量阳和汤、高剂量阳和汤热药含药血清处理后，GLC-82细胞变小、变圆，悬浮于培养液中，胞浆透亮度下降，核颜色加深，折光性增强；HE染色光镜观察，可见以上含药血清处理后，GLC-82细胞体积缩小，变圆，胞膜皱缩，胞核内染色质密度增高，呈半月形凝集在核膜周边，显示典型的凋亡细胞特点。其他血清组变化不明显。5 免疫细胞化学法检测结果显示，对照血清组和阳和汤非热药组的凋亡相关蛋白blc-2的表达呈强阳性。低、中、高剂量阳和汤组的含药血清组凋亡相关蛋白blc-2表达降低，均呈阴性。低、中、高剂量阳和汤非热药组的含药血清组凋亡相关蛋白blc-2表达也降低，呈弱阳性，但是其凋亡相关蛋白blc-2表达高于相对应的低、中、高阳和汤组的含药血清组。 结论：本研究显示：1阳和汤可明显抑制GLC-82细胞的增殖，可阻滞细胞周期于G0/G1期，减弱bcl-2的表达，诱导细胞凋亡，并存在一定的剂量-时间依赖性。提示阳和汤具有一定的抗肺癌作用，可能通过阻滞细胞周期和诱导凋亡发挥抗癌作用。2阳和汤热药可明显抑制GLC-82细胞的增殖，可阻滞细胞周期于G0/G1期，减弱bcl-2的表达，诱导细胞凋亡，并存在一定的剂量-时间依赖性。提示阳和汤热药具有一定的抗肺癌作用，可能通过阻滞细胞周期和诱导凋亡发挥抗癌作用。3高剂量的阳和汤非热药具有一定的抗肺癌作用，可以阻滞细胞周期于G0/G1期，诱导细胞凋亡，但是机制不明。4本实验提示：阳和汤在抑瘤率、阻滞细胞周期于G0/G1期、凋亡率、抑制抗凋亡蛋白bcl-2表达等方面作用较阳和汤热药和阳和汤非热药明显，而阳和汤热药在这些方面的作用较阳和汤非热药明显。说明阳和汤整方的抗肿瘤作用高于阳和汤热药和阳和汤非热药。阳和汤热药可能在阳和汤整方抗肿瘤作用中起主导作用。阳和汤非热药起着相同或者协同作用。初步证实中医温热药具有抗癌作用，支持癌症属阴寒的观点。

目录

摘要

前言

材料与方法

结果

附图一

附图二

附表

讨论

结论

参考文献

综述 中药逆转肿瘤多药耐药的研究新进展

致谢

个人简历