2-甲氧基雌二醇对K562细胞增殖、凋亡及粘附功能的影响及其机制研究

摘要

慢性粒细胞白血病(chronic myelocytic leukemia,CML)是起源于造血干细胞的克隆增殖性恶性血液病，90％以上CML患者出现9号和22号染色体易位形成Ph染色体和bcr/abl融合基因，此基因进一步转录合成具有高度酪氨酸激酶活性的bcr/abl融合蛋白，干扰造血干/祖细胞发育的信号转导过程，它是CML Ph 染色体阳性细胞逃避正常细胞增殖和凋亡调控系统，不断增殖并产生凋亡耐受及大量进入外周血的根本原因。CML 的主要特征为细胞过度增殖、凋亡受抑、粘附及迁移功能异常。 2-甲氧基雌二醇(2-Methoxyestradiol，2-ME) 为内源性雌激素代谢产物，2-ME对雌激素受体的亲和力较低，因此似乎并不是通过影响雌激素受体通路而起作用。2-ME抗肿瘤作用主要是通过抑制细胞增殖、诱导肿瘤细胞和内皮细胞凋亡、细胞周期停滞、抗血管新生及增强肿瘤细胞对辐射的敏感性而实现的。由于该药只对增殖活跃的细胞有作用，而对静止细胞无作用，因而不良反应较小，故近年来日益受到重视。迄今为止，尚无2-ME对白血病细胞增殖、凋亡、细胞周期及粘附功能影响的研究报道，国外仅有2-ME对CML细胞生物学影响的零星报道，但无2-ME对CML细胞L-选择素及bcr/abl基因表达影响的报道，我们采用新型抗肿瘤化合物2-ME体外研究对bcr/albl(+)CML急变期细胞系K562细胞增殖、细胞周期、凋亡及粘附功能的影响，并探讨其作用机制，为2-ME的临床应用提供某些实验依据，进而为CML的靶向治疗开辟一条新途径。 本研究分为如下四个部分。 第一部分 2-甲氧基雌二醇对K562细胞增殖及细胞周期的影响 目的：研究2-ME对慢性粒细胞白血病细胞系K562细胞增殖及细胞周期的影响。 方法：(1)实验分组：取对数生长期的K562细胞随机分为二组：①对照组：培养基中不含2-ME；②实验组：分别用1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L及16μmol/L浓度的2-ME处理K562细胞24h、36h、48h及60h后观察各项指标的变化。(2)细胞形态观察：倒置相差显微镜下观察各实验组细胞形态变化，于2-ME作用36h、形态学变化最显著时拍摄记录细胞形态。(3)四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定2一ME对细胞增殖的抑制作用。(4)流式细胞术(FCM)检测2-ME对K562细胞周期分布的影响。 结果：(1)细胞形态变化：2-MElμmol/L浓度组整个时间段细胞形态变化不明显；2μmol/L，浓度组于36h可见少许细胞变形、坏死，随着时间的延长变形、坏死的细胞有增多趋势；4μmol/L、8μmol/L、16μmol/L浓度组24h即可见细胞变形、核固缩、核碎裂和胞膜突起等现象，这种变化与2-ME浓度及时间呈正相关趋势。(2)2-ME对K562细胞增殖的影响：2-ME对K562细胞的生长抑制率各组之间均有显著性差异(P<0.01)。2．ME在1μmol/L～8μmol/L浓度范围内，对K562细胞的生长抑制率随浓度增高而逐渐增加，至16μmol/L时，细胞抑制率增加不明显；在24h～48h时间范围内，2-ME对K562细胞的生长抑制率随时间延长而逐渐增加，至60h时细胞抑制率无明显增加，提示在一定浓度和时间范围内，2-ME以时间-剂量依赖的方式抑制细胞生长。(3)2-ME对K562细胞周期的影响：在一定浓度范围(O～4μmol/L)内，随着2-ME浓度的增加，G<,0>/G<,1>期细胞逐渐增多，S期细胞逐渐减少，但2-ME浓度>4μmol/L后G<,0>/G<,1>期细胞比例不再增加。2-ME浓度为4μmol/L、8μmol/L、16μmol/L三组的G<,0>/G<,1>期细胞比例与对照组比较有统计学意义(P<0.05)。 结论：2-ME在一定的浓度和作用时间范围内，以剂量-时间依赖形式抑制K562细胞生长，细胞出现变形、核聚集、核碎裂和胞膜突起等形态改变。随着2-ME浓度增加和作用时间延长，处于G<,0>/G<,1>期的K562细胞比例逐渐增加，S期细胞逐渐减少。总之，2-ME在一定范围内呈时间和剂量依赖性抑制K562细胞增殖、阻滞K562细胞周期异常运行。 第二部分 2-甲氧基雌二醇对K562细胞凋亡及凋亡相关分子表达的影响 目的：研究2-ME对白血病K562细胞凋亡的影响，并从凋亡相关分子Caspase-3和XIAP的mRNA及其蛋白的水平探讨2-ME诱导K562细胞凋亡的某些机制。 方法：(1)原位细胞凋亡法(TUNEL)检测K562细胞凋亡率。(2)FCM检测K562细胞凋亡率。(3)FCM检测K562细胞凋亡相关分子Caspase-3及XIAP蛋白表达。(4)半定量 RT-PCR检测K562细胞Caspase-3及XIAP基因的表达。(5)黄嘌吟氧化酶法检测K562细胞超氧化物歧化酶(SOD)及活性氧(ROS)水平。 结果：(1)K562细胞凋亡率：实验组经K562细胞与2-ME 分别处理36h后，应用TUNEL法染色，显微镜下观察凋亡细胞较对照组明显增多。计算凋亡率结果显示，2-ME浓度为1μmol/L 时，凋亡率未见明显增加，之后随着2-ME浓度增加，K562 细胞凋亡率逐渐增加，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。2-ME浓度至16μmol/L 时，细胞凋亡率有所下降；应用FCM检测K562细胞凋亡率，得到相似结果。两种方法测得的K562细胞凋亡率呈正相关(γ=0.845,P=0.034)。(2)FCM检测K562细胞凋亡相关蛋白表达：随着2-ME浓度增加，Caspase-3 蛋白表达逐渐增加，与对照组比较均有显著性差异(P<0.05)；而随着2-ME浓度增加，XIAP蛋白表达逐渐降低，但与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。(3)半定量RT-PCR检测K562细胞凋亡相关基因表达：随着2-ME浓度增加，Caspase-3基因表达逐渐增加，与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.01)；而随着2-ME浓度增加，XIAP基因表达逐渐降低，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。Caspase-3与XIAP基因表达量之间呈负相关(γ=-0.966,P=0.000)。(4)2-ME对K562细胞SOD与ROS的影响：随着2-ME浓度增加，SOD活性逐渐降低，ROS活性逐渐增加，与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。SOD与ROS水平之间呈负相关(γ=-0.462，P=0.054)。 结论：(1)2-ME在一定的浓度范围内，呈剂量依赖形式诱导K562细胞凋亡。(2)2-ME通过上调促凋亡基因caspase-3和(或)下调抗凋亡基因XIAP的表达、抑制SOD及增加ROS水平等途径促进K562细胞凋亡，这可能是2-ME诱导K562细胞凋亡的机制之一。 第三部分 2-甲氧基雌二醇对K562细胞L-选择素及其基因表达的影响 目的：检测2-ME 对慢性粒细胞白血病细胞系K562细胞L-选择素及其基因表达的影响，并探讨其作用机制。 方法：(1)FCM检测K562细胞L-选择素蛋白表达。(2)半定量RT-PCR检测K562细胞L-选择素基因表达。 结果：(1)2-ME对K562细胞L-选择素蛋白表达的影响：FCM定量检测不同浓度2-ME与K562细胞作用36h后L-选择素蛋白表达，结果表明，随着2-ME浓度增加，L-选择素蛋白表达量逐渐增加，2-ME浓度为2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L、16μmol/L四组L-选择素蛋白表达量与对照组比较有统计学意义(P<0.05)。(2)2-ME对K562细胞L-选择素基因表达的影响：应用半定量RT-PCR检测与不同浓度2-ME作用36h后的K562细胞L-选择素基因表达，结果表明，随着2-ME浓度增加，L-选择素基因表达量逐渐增加，与对照组比较均有显著性差异(P<0.01)。 结论：2-ME 能够增加K562细胞L-选择素mRNA及其蛋白表达，因而改善或恢复K562细胞的粘附缺陷。 第四部分 2-甲氧基雌二醇对K562细胞bcr/abl融合基因表达的影响 目的：检测2-ME对白血病K562细胞bcr/abl mRNA及其蛋白P210表达的影响，并探讨其作用机制。 方法：(1)SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测K562细胞bcr/ablmRNA表达。(2)Western印迹法检测K562细胞bcr/abl融合蛋白P210表达。 结论：2-ME 不影响K562细胞bcr/abl融合基因mRNA表达水平，但可降低其bcr/abl融合蛋白水平，并与K562细胞的凋亡率呈负相关，这可能是2-ME诱导K562细胞凋亡的机制之一。 综上所述，CML 的主要特征为细胞过度增殖、凋亡受抑及粘附、迁移功能异常。本实验研究了新型抗肿瘤化合物2-ME对bcr/abl(+)CML急变期细胞系K562细胞增殖、凋亡、细胞周期及粘附功能的影响，发现其具有抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期、改善细胞粘附功能及降低细胞bcr/abl融合蛋白表达等作用，为2-ME的临床应用提供了一定的实验依据，提示2-ME在CML 具有潜在的临床应用价值。

目录

论文说明：英文缩写

摘要

引言

第一部分2-甲氧基雌二醇对K562细胞增殖及细胞周期的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分2-甲氧基雌二醇对K562细胞凋亡及凋亡相关分子表达的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分2-甲氧基雌二醇对K562细胞L-选择素及其基因表达的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第四部分2-甲氧基雌二醇对K562细胞bcr/abl融合基因表达的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述一2-甲氧基雌二醇的抗肿瘤作用研究进展

综述二L-选择素与慢性粒细胞白血病的相关性研究进展

致谢

个人简历