重组改构人肿瘤坏死因子增强顺氯氨铂抑制小鼠Lewis肺癌的作用及机制研究

摘要

目的：肺癌是全世界常见的恶性肿瘤，5年生存率仅10％左右。尽管近年来新的抗癌药物和化疗方案不断推出，但治疗效果仍无显著提高。如何寻找一种有效措施以提高化疗疗效是目前亟待解决的问题。生物化疗(Biochemotherapy)是生物治疗与化疗相结合的方法，与单用化疗相比，有疗效迭加及减轻毒副反应的作用，是目前肿瘤综合治疗新动向之一。肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor)属于生物制剂中细胞因子类，而细胞因子类的应用是目前最成熟的生物治疗方法[1]。本实验拟通过动物实验观察重组改构人肿瘤坏死因子(recombinant mutant human tumor necrosis factor，rmhTNF)是否能增强顺氯氨铂(cisplatin，DDP)对小鼠Lewis肺癌的化疗疗效，进一步阐明抗肿瘤血管生成是其增效化疗可能的作用机制之一，同时观察rmhTNF是否有改善免疫功能的作用，初步探讨rmhTNF联合DDP治疗肺癌的可行性。 方法：将体重为16～20克健康C57BL/6小鼠(60只)随机分为4组，生理盐水对照组(对照组，15只)，rmhTN-F单药组(15只)，DDP单药组(15只)，DDP+rmhTNF联合组(联合组，15只)。然后将小鼠Lewis肺癌(LLC)细胞株接种于各组小鼠右上肢腋窝皮下，构建动物实验模型[2]。随后隔日检查皮下肿瘤生长情况。接种第5天，约半数能扪及肿瘤，第7天，都能扪及肿瘤，待第12天，扪及皮下肿瘤平均大小约(1.0×1.0 × 1.0)cm3时开始进行瘤内注药[3、4]。对照组瘤内注射生理盐水0.2mL/只，rmhTNF单药组瘤内注射rmhTNF 0.2mL/只(150万IU/kg)，DDP单药组瘤内注射DDP 0.2mL/只(6.15mg/kg)，联合组瘤内注射DDP(6.15mg/kg)和rmhTNF(150万IU/kg)各0.2mL/只。以上四组每天给药一次，连续3天[5]，给药第一天开始观察小鼠的生活状态。末次给药后24小时集体脱颈处死小鼠，立即完整剥离肿瘤组织，称取并记录每个瘤体的重量(g)及小鼠去肿瘤后重量(g)，测量并计算每个肿瘤体积(mm3)，各组肿瘤抑制率，同时取瘤组织，通过逆转录.聚合酶链反应(revers transcription PCR，RT-PCR)半定量检测低氧诱导因子(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)mRNA的表达水平。应用免疫组织化学(immunohistoche-mistry，IHC)方法定性观察血管内皮生长因子(vascular endot-helial growth factor，VEGF)及其受体(vascular endothelial gro-wth factor receptor-2，VEGFR-2/KDR)蛋白的表达情况。采用流式细胞术(flow cytometry，FCM)半定量检测基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)蛋白的表达水平。 结果： 1.小鼠生活状态、最终去瘤体重：各治疗组小鼠均有轻到中度的脱毛，食欲下降，活动迟缓，精神萎靡，rmhTNF单药组生活状态最佳，联合组较DDP单药组生活状态好。rmhTNF组的小鼠最终去瘤体重高于对照组(P＜0.05)，其他治疗组小鼠最终去瘤体重与对照组相比均有下降(P＜0.05)，联合组小鼠的最终去瘤体重高于DDP组(P＜0.05)。 2.瘤重、体积、抑瘤率：单药组平均肿瘤体积和平均瘤重均低于对照组(P＜0.05)；联合组的肿瘤体积、平均瘤重低于各单药组(P＜0.05)，抑瘤率高于各单药组(P＜0.05)。两单药组之间无明显差异(P＞0.05)。 3.半定量RT-PCR检测HIF-1αmRNA结果：两单药组的HIF-1α mRNA表达水平较对照组明显下降(P＜0.05)，联合组的表达水平明显低于两单药组(P＜0.05)，两单药组之间无明显差异(P＞0.05)。 4 免疫组化检测VEGF、KDR蛋白表达结果：两单药组VEGF、KDR表达均低于对照组(P＜0.05)，联合组VEGF、KDR表达均低于各单药组(P＜0.05)，两单药组表达水平之间无显著差异(P＞0.05)。 5 VEGF和KDR蛋白表达相关性检测结果：免疫组化结果显示小鼠Lewis肺癌组织的对照组、rmhTNF组、DDP组和联合组的VEGF和KDR蛋白表达均具有正相关性，r值分别为0.703，0.538，0.644，0.608，P值分别为0.003，0.039，0.010，0.016。6 流式细胞术检测MMP-2结果：单药组的MMP-2表达水平较对照组明显下降(P＜0.05)，联合组的表达水平明显低于两单药组(P＜0.05)，两单药组之间无明显差异(P＞0.05)。 结论： 1.rmhTNF和DDP单用对小鼠Lewis肺癌均有抗瘤特性，而两药联合作用明显增强，rmhTNF能够增强DDP对小鼠Lewis肺癌的抑制作用，并能改善小鼠的免疫功能。 2.rmhTNF和DDP单用均能抗肿瘤血管生成，而联合应用其抗肿瘤血管生成作用更加显著，进一步反映rmhTNF可能通过抗肿瘤血管生成的机制增强化疗疗效。 3.rmhTNF、DDP可能通过基因水平上对HIF-1α的抑制，导致HIF-1α蛋白水平的表达降低，从而降低VEGF蛋白的表达，进一步影响KDR蛋白的表达；同时也可以抑制MMP-2蛋白的表达，从而抑制肿瘤血管生成，最终达到抗肿瘤的作用。 4 小鼠Lewis肺癌中有HIF-1α mRNA、VEGF、KDR和MMP-2的表达，且VEGF和KDR的表达有明显的正相关性。 5 本实验为rmhTNF和化疗药物联合应用治疗肺癌以提高疗效提供了理论依据，为肺癌的综合治疗提供了新的选择。

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材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 抗肺癌血管生成机制及靶向治疗药物研究进展

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