百草枯中毒大鼠肾组织中HGF与TGF-β的表达及促肝细胞生长素的治疗干预研究

摘要

目的：百草枯(paraquat，PQ)，是目前世界范围内使用广泛的有机杂环类接触性除草剂，随着其在我国农业上的广泛应用，PQ中毒也日趋增多。PQ对人畜均有较强毒性，经皮肤接触、呼吸道及消化道进入体内，造成急性中毒。中毒致死剂量小，病程进展快，且尚缺乏特效解毒剂及有效降低毒物毒性的治疗手段，临床上病死率高。PQ以原形的形式主要经肾脏排泄，这也是导致肾脏损伤的主要原因。目前PQ经肾脏排泄的确切机制及PQ中毒致肾组织损伤机制均尚不完全明确。本研究通过观察PQ染毒大鼠肾组织病理变化，测定血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)的变化，肾组织匀浆丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量、超氧化物歧化酶(superoxidedismlnase，SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxidase，GSH-Px)的活力，并应用免疫组织化学方法观察肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor，HGF)与转化生长因子-β1(Trarlsforming growth factor-β1，TGF-β1)在PQ中毒大鼠肾组织中的表达及相互作用，以及促肝细胞生长素(Hepatocyte Growth-promoting Factors，pHGF)对上述指标的干预影响，进一步探讨PQ中毒致肾损伤的机制及促肝细胞生长素对PQ中毒大鼠肾损伤的预防及治疗作用。 方法：选择健康成年SD(Sprague-Dawley)大鼠108只，随机分为三组：①对照组(A组)36只；②染毒组(B组)36只；③pHGF治疗组(C组)，36只。B、C组一次性给予25mg/kgPQ腹腔注射染毒，A组给予等量的生理盐水腹腔内注射，之后，C组立即给予pHGF1mg/kg腹腔注射，每12h一次，最长用药时间为14天，B组给予与C组等量生理盐水腹腔注射。A、B、C组分别于染毒后1d、3d、5d、7d、10d、14d各取6只大鼠，乙醚麻醉后腹主动脉取血处死，血液离心后取血清备测定血清BUN、Cr含量；而后迅速留取左肾上极组织，制成10％肾组织匀浆测定MDA含量、SOD及GSH-Px活力，其余肾组织用10％甲醛固定，HE染色观察病理学改变及免疫组织化学法观察HGF及TGF-β1在中毒大鼠肾组织中的表达。 结果：1.大鼠中毒表现：大鼠于染毒后30min～2h即可出现中毒表现，B组主要表现为：倦怠、嗜睡、烦躁、进食水明显减少；呼吸急促、张口呼吸、口周紫绀；血尿、少尿或无尿；走路不稳、肢体无力、头颤；松毛、眼鼻血性分泌物等；C组经pHGF治疗后中毒表现较B组减轻，呼吸困难明显改善，血尿情况改善，少尿、无尿时间均明显缩短。 2.PQ中毒大鼠肾组织形态学变化(1)大体标本A组：正常大鼠肾脏外观不肿，色泽正常； B组：染毒大鼠肾脏外观肿胀，被膜紧张，颜色深呈紫黑色，表面有散在出血点； C组：pHGF干预后大鼠肾脏外观肿胀减轻，色泽红，表面无明显出血点。 (2)HE染色A组(Fig.4)：肾脏各部分结构在各时间点均无明显病理变化； B组(Fig.5-9)：①肾小球：改变相对轻微，仅为肾小球充血肿胀，炎性细胞浸润；②肾小管：1d时肾小管部分上皮细胞水肿、空泡变性，3d时肾小管上皮细胞均见水肿、渗出、坏死，管腔内可见红色颗粒状坏死物，肾小管上皮间断性损伤部位可见再生上皮细胞；5d时肾小管上皮细胞仍有水肿、坏死，管腔内坏死物减少；7～10d时肾小管上皮细胞水肿减轻，管腔中坏死物逐渐减少，部分肾小管损伤已修复；14d时肾小管上皮细胞水肿消退，腔内坏死物逐渐溶解消失，肾小管上皮细胞结构基本正常；③肾间质：水肿、充血伴大量炎性细胞浸润； C组(Fig.10-12)：pHGF干预后明显减轻了肾脏病理改变，加速了损伤后的修复。①肾小球：充血肿胀明显减轻；②肾小管：1d时可见肾小管上皮细胞水肿减轻，无明显坏死；3d时仅有小部分肾小管上皮细胞出现坏死，管腔内可见少量坏死物，肾小管损伤部位可见较多再生上皮细胞；5d时肾小管上皮细胞轻度水肿，部分损伤肾小管己修复；7～10d时肾小管上皮细胞水肿消退，管腔中坏死物消失，损伤已基本修复；14d时肾小管上皮细胞结构正常。③肾间质：可见炎性细胞浸润。 3.血清BUN、Cr测定(table 1)A组：血清BUN、Cr各时段均在正常范围内； B组：BUN于第1d显著升高，第3d达高峰，1d、3d、5d各时间点与A组比较有统计学意义(P＜0.05)；5d后存活大鼠可逐渐下降，7～14d时段逐渐恢复正常，与A组比较无意义(P＞0.05)；A、B两组比较Cr变化无统计学意义(P＞0.05)： C组：BUN在1d、3d时较B组降低，具有统计学意义(P＜0.05)，5d、7d时段仍较B组降低，但无统计学意义(P＞0.05)；1d、3d时与A组比较有统计学意义(P＜0.05)，以后各时间点与A组比较无意义(P＞0.05)；三组比较Cr变化均无统计学意义(P＞0.05)。 4.肾组织匀浆MDA、SOD及GSH-Px变化(table 2) 4.1 MDA测定(Fig.1，table 2)B组：染毒后1d、3d和5d各时间点MDA含量明显高于A组(P＜0.01)，7d、10d时段逐渐下降，但仍高于A组(P＜0.05)，14d时与A组比较无统计学意义(P＞0.05)； C组：染毒后1d、3d及5d各时间点MDA均较B组明显降低(P＜0.05)，7～14d各时间点与B组比较无统计学意义(P＞0.05)；1d和3d时段高于A组(P＜0.05)，其它各时间点与A组比较均无统计学意义(P＞0.05)。 4.2 SOD测定(Fig.2，table 2)B组：染毒后1d、3d时段SOD活力均明显低于A组(P＜0.01)，5d和7d时段仍低于A组(P＜0.05)，10d、14d及SOD活力逐渐升高，与A组比较无统计学意义(P＞0.05); C组：染毒后1d、3d、5d及7d各时间点SOD活力均较B组升高(P＜0.05)；但1d与3d时明显低于A组(P＜0.01)，其它各时间点与A组比较均无统计学意义(P＞0.05)。 4.3 GSH-Px活性检N(Fig.3，table 2)B组：染毒后1 d和3d时GSH-Px活力低于A组(P＜0.05)，5d及以后各时间点活力逐渐升高，与A组比较无统计学意义(P＞0.05)； C组：染毒后1d和3d时段GSH-Px活力较B组增高(P＜0.05)，其余各时间点与B组比较无统计学意义(P＞0.05)；各时间点与A组比较无统计学意义(P＞0.05)。 5治疗前后肾组织HGF及TGF-β1的免疫组织化学检测结果(Table 3) 5.1HGF在大鼠肾组织中的表达与分布(Fig.13-25)A组(Fig.13)：HGF仅在肾小管少许表达； B组(Fig.14-19)：于染毒后1d，即可发现HGF在肾小管上皮细胞的细胞核中表达，3d达高峰，与A组比较有统计学意义(P＜0.01)，此后开始缓慢下降，5～7d仍强于A组，与A组比较有统计学意义(P＜0.05)；10～14d以后与A组相比无统计学意义(P＞0.05)； C组(Fig.20-25)：HGF仍主要表达于肾小管上皮细胞的细胞核中，且表达自1～7d各时间点均较B组明显增强(P＜0.01)，10～14d与B组比较仍有统计学意义(P＜0.05)；在1～7d各时间点均明显高于A组(P＜0.01)；10～14d对与A组比较仍有统计学意义(P＜0.05)。 5.2TGF-β1在大鼠肾组织中的表达与分布(Fig.26-38)A组(Fig.26)：可见TGF-β1在肾小管上皮细胞的胞质中微弱表达； B组(Fig.27-32)：染毒后1d，TGF-β1表达明显增强，7d达高峰，1～10d各时间点与A组相比，差异均具有统计学意义(P＜0.01)；14d仍有表达，与A组相比仍有统计学意义(P＜0.05)；C组(Fig.33-38)：染毒后1d，TGF-β1在肾小管上皮细胞的胞质中亦出现表达，1～14d各时间点与B组相比均减弱，差异均有统计学意义(P＜0.05)；但与A组相比，1～7d各时间点TGF-β1的表达明显高于A组，差异具有统计学意义(P＜0.01)，10～14d与A组比较仍有统计学意义(P＜0.05)。 结论1.百草枯腹腔注射染毒可引起肾损伤，且主要表现为肾小管上皮细胞损伤，表明百草枯腹腔注射染毒是制造急性肾损伤动物模型的可靠办法； 2.百草枯中毒大鼠血清BUN于1d开始升高，3d可达高峰，7～14d可恢复正常，证实百草枯致肾损伤时可出现BUN改变；Cr变化无统计学意义； 3.百草枯中毒大鼠体内MDA水平升高、SOD及GSH-Px活力下降，提示体内存在过氧化损伤及氧化。抗氧化失衡，可能是百草枯致肾损伤的机制之一； 4.百草枯中毒大鼠肾组织中HGF及TGF-β1主要在肾小管表达，可能是肾小管损伤与修复过程中的一对重要互逆平衡因素； 5.促肝细胞生长素治疗后，可明显降低百草枯中毒大鼠肾组织MDA含量，增加SOD及GSH-Px活力，从而减轻氧化应激对肾组织和细胞的损伤； 6.促肝细胞生长素可通过促进体内HGF的合成及表达，间接抑制TGF-β1，的表达，从而抑制肾小管损伤，促进肾小管上皮细胞修复和再生，减轻百草枯中毒所致肾损伤。

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综述 HGF/C-met对中毒性肾病的保护作用

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