D9S1122/D10S1435/D12ATA63/D17S1301/D18S853/D20S1082 miniSTR基因座四色荧光标记分型体系的构建及法医学应用

摘要

目的：短串联重复序列(short tandem repeats，STR)又称微卫星DNA，是由1-6个碱基串联重复而成的DNA序列。STR绝大部分分布于人类基因组非编码区，少数分布在编码区，平均每6-10kb就有一个STR基因座。由于STR基因座在人类基因组中分布广泛，具有高度的遗传多态性以及简单快捷的检测方法而被广泛应用于遗传制图、遗传连锁性分析、肿瘤研究、人类学、法医学、疾病基因定位、物种多态性研究等诸多领域。在法医DNA检验中，STR技术已经广泛用于个人识别和亲权鉴定方面。但对于法医学中一些微量降解的检材，STR技术并不能成功地得出结论，经常会出现“优势扩增”或者“无效扩增”，而miniSTR分析技术是将引物设计得尽可能靠近核心序列来缩短扩增片段长度，因此将其用于高度降解DNA样本检测可提高个人识别和亲子鉴定中的检测成功率。MiniSTR基因座已被欧洲DNA分型工作组(EDNAP)定义为继STR之后的新一代遗传标记，2006年美国AB公司已经研制开发了miniSTR扩增试剂盒；美国、日本、西班牙等国家报道了miniSTR D1S1677、D4S2364、D10S1248等基因座的群体遗传学数据及其法医学应用价值，国内对miniSTR基因座的研究较少，且多是对CODIS系统内miniSTR基因座进行的调查研究。在人类基因组中已经发现的8000多个STR基因座，并非都适用于设计成miniSTR基因座，特别是CODIS系统内的部分STR基因座由于等位基因范围太大，或者侧翼序列不适合设计新的引物，使这些基因座扩增片段长度很难缩短到理想长度(＜150bp)。本课题旨在建立两组非CODIS系统的miniSTR基因座D9S1122、D10S1435、D12ATA63和D20S1082、D18S853、D17S1301荧光标记复合扩增体系，对河北汉族人群进行群体遗传学调查，按照美国DNA分析方法技术工作组(The Technology Working Group on DNA Analysis Methods，TWGDAM)的指导方案进行法医学实用性研究，为DNA数据库的构建及法医学应用提供基础资料。 方法：本实验所用河北健康无关个体外周静脉血115份，由河北省血液中心提供，基因组DNA的提取采用天根生化公司的血液基因组DNA提取试剂盒提取；家系调查的检材来源于法医物证教研室日常亲子鉴定检案，组织同一性检验的检材来源于法医病理教研室尸检标本，采用Chelex-100法提取上述检材的DNA；另将静脉血放置于夏季自然环境中1周、2周、4周、8周模拟降解检材，采用Chelex-100两步法提取其DNA。将D12ATA63、D17S1301基因座的上游引物5’端用6-FAM荧光标记，D9S1122、D20S1082基因座的上游引物5’端用HEX荧光标记，D10S1435、D18S853基因座的上游引物5’端用TAMRA荧光标记。分别对D20S1082、D18S853、D17S1301与D9S1122、D10S1435、D12ATA63进行PCR复合扩增，扩增产物在AB1310基因分析仪上电泳分型，结果用Genemapper 3.2软件进行分析，利用统计软件计算各基因座的遗传学参数。 结果：建立了D9S1122、D10S1435、D12ATA63与D20S1082、D18S853、D17S1301两组荧光标记复合扩增体系。115份全血样本中，基因座D9S1122检出8个等位基因和22种基因型；D10S1435检出7个等位基因和23种基因型；D12ATA63检出5个等位基因和12种基因型；D20S1082检出8个等位基因和18种基因型；D18S853检出6个等位基因和15种基因型；D17S1301检出7个等位基因和17种基因型。在河北汉族人群中的杂合度观察值(heterozygosity,H)分别依次为0.736、0.806、0.841、0.776、0.765、0.767：多态性信息含量(polymorphism information content，PIC)分别依次为0.720、0.750、0.630、0.700、0.670、0.690；非父排除率(excluding probability of patemity,EPP)分别依次为0.486、0.609、0.677、0.571、0.555、0.540；个人识别力(discrimination power,DP)分别依次为0.894、0.900、0.706、0.855、0.858、0.848。六个基因座累积非父排除概率为0.994299，累积个人识别力为0.999990。按照TWGDAM指导方案的基本要求，对该体系进行了法医实用性研究。该体系对同一个体的心脏、肝脏、肾脏、肌肉组织检测结果分型一致；一些常见动物兔、鱼、猪、鸡未检测到特异性扩增产物；在9个家系调查中没有发现突变；对于1周、2周、4周、8周的降解检材都可以成功分型。 结论：本文建立了两组法医学遗传标记D20S1082、D18S853、D17S1301与D9S1122、D10S1435、D12ATA63miniSTR四色荧光标记复合扩增体系；该体系的群体遗传学调查表明：该6个miniSTR基因座具有高度遗传多态性，可用于法医学亲子鉴定和个人识别；该体系分型准确、灵敏度高、重复性好，具有种属特异性、组织同一性及较好的遗传稳定性，并且对于分析微量、降解检材较商品化STR试剂盒具有明显优势，表明该体系可用于法医学实践。

目录

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摘要

第一部分D9S1122/D10S1435/D12ATA63/D20S1082/D18S853/D17S1301miniSTR基因座四色荧光标记分型体系的构建及河北汉族人群的群体遗传学调查

前言

材料与方法

结果

附图、附表

讨论

小结

参考文献

第二部分 miniSTR基因座 D9S1122/D10S1435/D12ATA63/D20S1082/D18S853/D17S1301四色荧光标记分型体系的法医学应用

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

附录

综述 miniSTR基因座复合扩增与法医学应用的研究进展

致谢

个人简历