大蒜素对TRAIL诱导卵巢癌细胞SKOV-3凋亡影响的体外实验研究

摘要

目的：卵巢癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率高，治疗效果差。随着新辅助化疗的发展和医学模式的转变，化疗己成为卵巢癌治疗中不可或缺的治疗手段。在卵巢癌的化疗中，使用一些毒性小的抗肿瘤药物，充分发挥其治疗作用，减少对正常细胞的损伤，成为当前研究的一大热点。TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand)是新近发现的肿瘤坏死因子TNF家族成员，能够选择性地诱导肿瘤细胞凋亡且不影响正常细胞的生长分化，在肿瘤治疗方面具有潜在的应用价值。大蒜素(Allicim)是大蒜中主要生物活性成分的总称。近年来，实验证实大蒜素能够通过诱导肿瘤细胞凋亡抑制肿瘤的发生。 本研究以人卵巢癌SKOV-3细胞株为对象，探讨大蒜素与TRAIL单独及联合应用对卵巢癌细胞生长的影响及其作用机理，从而为临床上卵巢癌的化疗提供新的思路。 方法： 1. 细胞培养：常规复苏冻存的SKOV-3细胞接种于100ml培养瓶中，加入青、链霉素，使青霉素浓度为100IU/ml，链霉素浓度为100ug/ml，37℃、5％CO2饱和湿度培养箱内松盖培育。以0.25％胰蛋白酶消化传代。 2.细胞增殖实验：取对数生长的SKOV-3细胞，制成浓度为6x104个/ml的细胞悬液，接种到96孔培养板，每孔100ul，置于37℃CO2培养箱中培养，24h后更换培养液，按以下几组分别加入含药培基：(1) 含有不同浓度大蒜素(12.5、25、50、75mg/L)的培养基；(2) 含有不同浓度TRAIL蛋白(25、50、100、200ng/ml)的培养基；(3) 含有100ng/ml的TRAIL蛋白和50mg/L大蒜素的培养基；(4) 空白对照孔(只加培养基)。每一浓度均设6个平行孔。继续培养24、48和72小时后，每孔加入10ul浓度为5mg/ml的MTT溶液，放回培养箱继续孵育4小时。吸净上清液，每孔加入二甲基亚砜100ul，振荡器上振荡8-10min，用酶标光度仪在波长为492nm时测定每孔的吸光度(OD)值。每个实验均重复3次。 3.流式细胞仪检测大蒜素对SKOV-3细胞TRAIL死亡受体DR4、DR5表达的影响：将浓度为4.5x104个/ml细胞接种于培养瓶。待细胞生长至对数生长期，换培养液，分为对照组(仅加培养基)、大蒜素组(加入含大蒜素50mg/L的培基)，培养24h后，收集细胞，上样流式细胞仪进行死亡受体表达量分析，以检测样品荧光指数(FI)表示。实验重复三次取平均值计算大蒜素处理前后细胞死亡表达的FI值。 4.用Caspase活性检测试剂盒检测大蒜素对SKOV-3细胞株Caspase-3、8活性的影响：将浓度为4.5x104个/ml细胞接种于接种于培养瓶。待细胞生长至对数生长期，换培养液，分为对照组(仅加培养基)、大蒜素组(力口入含大蒜素50mg/L的培基)，培养48h后，收集细胞，按照说明书操作，用分光光度计测定OD405。通过OD试验组/OD空白组的比值检测大蒜素对卵巢癌SKOV-3细胞Caspase-3、8活化程度的影响。实验重复三次。 5.RT-PCR法检测大蒜素对SKOV-3细胞TRAIL死亡受体DR4、DR5及Caspase-3、8表达的影响：取对数生长期细胞以4.5x104/ml的密度接种于培养瓶，置于孵箱中培养，待每瓶细胞生长至80-90％时，设对照组(仅加培养基)和加药组(含50mg/L大蒜素的含药培基)，继续培养8小时后，收集细胞提取总RNA，cDNA的合成，PCR的扩增及琼脂糖凝胶电泳。凝胶成像系统观察DR4、DR5及Caspase-3、8与β-actin基因扩增产物电泳条带的吸光度比值，表示DR4、DR5与Caspase-3、8的相对表达水平。实验重复三次，取平均值。统计学方法：细胞吸光度值(OD)和DR4、DR5、Caspase-3、8表达用-X±s表达，两个样本均数的比较用t检验；三组及以上资料的多组间比较，采用方差分析。计数资料用χ2检验。所有数据均用SAS软件包进行统计。P<0.05为差异有显著性意义。 结果： 1.SKOV-3细胞的形态学观察：倒置显微镜观察：对照组细胞生长状态良好，细胞伸展，呈梭形。加药培养24h后细胞数目减少，细胞明显皱缩，体积变小，细胞间隙增大，有凋亡小体形成。 2.大蒜素和TRAIL对SKOV-3细胞生长影响：大蒜素和TRAIL单独以及联合应用处理人卵巢癌SKOV-3细胞24、48、72h后，随着药物浓度和作用时间的增加，抑制率增高，表现为时间和剂量依赖关系。各组细胞抑制率与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。 3.流式细胞仪检测：大蒜素作用24小时后SKOV-3细胞TRAIL死亡受体的表达明显上调，DR4、DR5的FI值分别由用药前的1.78、1.94升高到2.27、2.58，用药前后DR4、DR5表达差异有统计学意义(P<0.05)。 4.Caspase-3、8活性检测：经大蒜素作用48小时后，SKOV-3细胞Caspase-3、8活性明显增加，Caspase-3、8活性的OD试验组/OD空白组分别是用药前的2.49、2.08倍，用药前后Caspase-3、8活性差异有统计学意义(P<0.05)。 5.RT-PCR检测：经大蒜素作用8小时后，DR4、DR5及Caspase-3、8 mRNA基因扩增产物与β-actin基因扩增产物电泳带的吸光度比值明显升高，DR4、DR5为对照组的1.45、1.52倍，Caspase-3、8分别为对照组的2.03、1.55倍，差异有统计学意义(P<0.05)。 结论：(1) 卵巢癌SKOV-3细胞是大蒜素和TRAIL敏感细胞株。(2) 大蒜素可以增强TRAIL诱导细胞凋亡作用。(3) 大蒜素上调卵巢癌SKOV-3细胞TRAIL死亡受体DR4、DR5的表达是其增强TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡的机制之一。(4) 大蒜素上调Caspase-3、8 mRNA的表达、并激活Caspase-3、8蛋白酶是其增强TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡的另一重要机制。 上述结论为大蒜素和TRAIL应用于临床肿瘤的辅助治疗提供充分的实验室依据。

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材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 TRAIL在卵巢癌治疗中的研究进展

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