MBP主动免疫对出血性卒中保护机制的初步研究

摘要

第一部分髓鞘碱性蛋白主动免疫：上调效应性T胞的免疫应答，促进出血性卒中大鼠的康复 目的：应用髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)对实验性脑出血大鼠进行免疫注射，通过测定大鼠脑组织中的神经胶质酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)和脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)的表达，观察MBP对出血性卒中的保护作用。同时测定脾脏中某种免疫性T细胞的特异性基因片段的表达，探讨MBP神经保护作用的机制。 方法： 1动物分组及饲养：健康成年雌性SD大鼠，90只，体重300a±20g。造模成功(Longa五级评分大于2分者视为成功)后随机分为MBP免疫组、磷酸盐缓冲盐水(phosphatebuffered saline，PBS)组、卵白蛋白(ovalbumin，OVA)组每组各30只，各组分为1d，3d，7d，14d，21d，五个亚组，每亚组6只。其中PBS组和OVA组为MBP免疫组的对照组。为同一条件下饲养。 2动物模型及取材：大鼠腹腔注射麻醉后，在尾动脉抽取动脉血，应用立体定位技术，在鼠脑的右侧基底节区注射自体尾动脉血50μl模。麻醉清醒后参照Longa五级评分法[1]评分，立即用不完全性弗氏佐剂乳化的MBP、OVA、PBS在相应组别大鼠的脚蹼进行皮下注射。每天进行Longa评分，不同亚组按相应时间点取材。常规麻醉，胸腹腔联合切开，结扎脾脏动静脉后，摘脾存于-80℃液氮中。暴露大鼠的心脏，经左心室插管，用4％多聚甲醛0.1 mol/L等灌注固定后迅速断头取脑，取脑出血周围组织，在4％的多聚甲醛中固定24h后，进行酒精梯度脱水，二甲苯透明、浸蜡，石蜡包埋。 3.结果测定：a.免疫组化取出血肿周围脑组织，分别进行GFAP和BDNF的免疫组化检查。b.逆转录聚合酶链式反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)取脾组织制作匀浆，提取RNA，RT-PCR产物半定量，用UVP凝胶图像成像系统拍摄打印实验结果，用凝胶图像分析系统分析结果。计算Foxp3与β-actin的相对密度值，以此代表目的片断的相对表达值。 4 数据资料以均数加减标准差表示，组间两两比较采用单因素方差分析LSD检验；脑组织免疫组化结果比较采用秩和检验。统计数据用SPSS 11.5统计软件处理，P＜0.05有统计学意义。 结果： 1.MBP组大鼠与OVA组及PBS组在对应时间点应用Longa氏五级评分法进行神经功能缺损评分，显示前者高于后两者并有显著差异(P＜0.05)，而且MBP组大鼠的神经功能恢复时间较对照组早，OVA组与PBS组比较未见显著差异； 2.GFAP和BDNF的表达，二者在各组中均为第一天最高，之后各天逐渐下降。但MBP组均高于相应对照组(GFAP指标P＜0.01，BDNF指标P＜0.05)，说明效应性T细胞活性增加。OVA组与PBS组比较未见显著差异； 3.Foxp3mRNA在MBP干预组干预组的大鼠脾脏中的表达与相应的对照组比较，均表达减低，且有明显差异(P＜0.01)。OVA组与PBS组比较未见显著差异； 结论： 1.MBP对实验性脑出血后大鼠的行为学缺损有治疗作用，可减轻症状。 2.MBP能上调BDNF，GFAP蛋白表达水平，对血肿周边神经元产生保护作用，3 MBP对实验性脑出血大鼠进行干预，降低FoxpmRNA的表达4 MBP的免疫保护机制是直接上调CD4+Th1细胞的免疫应答，并且下调CD4+CD25+调节性T细胞对CD4+Th1细胞的抑制作用。促进中枢神经系统损伤的恢复。 第二部分多巴胺：下调CD4+CD25+调节性T细胞活性，促进出血性卒中大鼠的恢复 目的：应用Dopamine对实验性脑出血大鼠进行腹腔注射，观察CD4+CD25+T细胞对中枢神经系统损伤恢复的抑制作用，研究多巴胺(Dopamine)对出血性卒中的神经保护作用机制。 方法： 1.动物分组及饲养：健康成年雌性SD大鼠90只，体重300±20g，造模成功(Longa五级评分大于2分者视为成功)后随机分为Dopamine治疗组、生理盐水(NS)对照组(N=30)，各组分为1d，3d，7d，14d，21d，五个亚组，每组6只。同一条件下饲养。 2.动物模型及取材：大鼠腹腔注射麻醉后，在尾动脉抽取动脉血，应用立体定位技术，在鼠脑的右侧基底节区注射自体尾动脉血50μl造模。麻醉清醒后参照Longa五级评分法[1]评分，立即用Dopamine和生理盐水给相应组别大鼠进行腹腔注射。每天进行Longa评分，不同亚组按相应时间点取材。常规麻醉，胸腹腔联合切开，接扎脾脏动静脉后，摘脾存于-80℃液氮中。暴露大鼠的心脏，经左心室插管，用4％多聚甲醛0.1 mol/L等灌注固定后迅速断头取脑，取脑出血周围组织，在4％的多聚甲醛中固定24h后，进行酒精梯度脱水，二甲苯透明、浸蜡，石蜡包埋。 3.结果测定：a.免疫组化取出血周围脑组织，分别测GFAP(胶质纤维酸性蛋白)和BDNF(脑源性神经营养因子)的免疫组化评分。b.逆转录聚合酶链式反应(ReverseTranscription-Polymerase Chain Reaction， RT-PCR、)取脾组织制作匀浆，提取RNA， RT-PCR产物半定量，用UVP凝胶图像成像系统拍摄打印实验结果，用凝胶图像分析系统分析结果。计算Foxp3与β-actin的相对密度值，以此目的片断的相对表达值，表达CD4+CD25+T细胞的活性。 4 数据资料以均数加减标准差表示，组间两两比较采用t检验；脑组织免疫组化评分比较采用秩和检验。统计数据用SPSS 11.5统计软件处理，P＜0.05有统计学意义。 结果： 1.Dopamine组大鼠与NS组在对应时间点应用Longa氏五级评分法[1]进行神经功能缺损评分，结果显示前者高于后两者并有显著差异(P＜0.05)，而且Dopamine组大鼠的神经功能恢复时间较对照组早。 2.GFAP和BDNF在实验大鼠脑中的表达，二者在各组中均为第一天最高，之后各天逐渐下降。Dopamine组均高于相应对照组(P＜0.01)。 3.Foxp3mRNA在Dopamine组的大鼠脾脏中的表达与相应的对照组比较，均表达减低，且有明显差异(P＜0.01)。 结论： 1.CD4+CD25+调节性T细胞对中枢神经系统损伤的恢复有抑制作用。 2.在实验性脑出血大鼠脑内BDNE，GDNF蛋白表达增强，Dopamine能上调BDNF, GDNF蛋白表达水平。 3.Dopamine可降低FoxpmRNA的表达，说明Dopamine可下调CD4+CD25+调节性T细胞对D4+Th1细胞的抑制作用，促进损伤的恢复。

目录

声明

摘要

引言

第一部分髓鞘碱性蛋白主动免疫：上调效应性T细胞的免疫应答，促进出血性卒中大鼠的康复

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

结论：

第二部分多巴胺：下调CD4+CD25+调节性T细胞促进出血性卒中大鼠的恢复

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

结论

参考文献

综述 CD4+CD25+调节性T细胞在中枢神经系统损伤中作用

致谢

个人简历