实验性大鼠脑缺血后脑红蛋白的动态表达及保护机制研究

摘要

目的：脑血管病是临床常见病和多发病，以其高发病率、高致残率和高病死率，严重影响着患者的预期寿命和生活质量，其中缺血性脑血管病占全部脑血管病的70％。脑梗死损伤的机制十分复杂，缺乏有效的干预手段。目前认为参与脑梗死损伤的病理生理机制与细胞内钙超载、细胞凋亡、兴奋性氨基酸的兴奋毒性、氧自由基产生过多所致的氧化应激等因素有关。出血性脑梗死(hemorrhagic infarction,HI)又称脑梗死后出血性转变(hemon-hagic transformarion,HT)是急性缺血性脑卒中的常见并发症。近年来由于抗凝与溶栓治疗的广泛应用，CT等影像学检查的普及，关于HI的报道逐渐增多，但确切病理生理机制尚不清楚，亦无确定有效的治疗方法。脑红蛋白(neuroglobin，Ngb)是2000年由Burmester等德国科学家首先发现的一种新的携氧球蛋白，广泛表达于神经组织，在神经系统氧的摄取、运输和利用等生理过程中起重要作用。研究发现缺氧、缺血条件下Ngb表达升高，并且对神经系统缺氧、缺血损伤具有重要的神经保护功能。Ngb在mRNA和蛋白水平均可被氯化血红素(Hemin)所诱导，并呈时间和浓度依赖性。免疫共沉淀实验证明Na+，K+-ATP酶β2亚基与Ngb以复合物的形式存在，推测Ngb有可能通过对Na+，K+-ATP酶所具有的离子环境内稳态的调节功能发挥神经元保护作用。本研究拟通过观察大鼠脑梗死模型、出血性脑梗死模型中Ngb的动态表达及Hemin对其表达的影响，探讨Ngb对脑保护的可能机制，以期为临床采用Ngb刺激物治疗缺血缺氧性疾病提供理论根据。方法：200只SD大鼠随机分为4组，即大脑中动脉闭塞(middle cerebral arlery occlusion，MCAO)模型组，出血性脑梗死(hemorrhagic infarction, HI)模型组，Hemin干预组和假手术对照组。缺血模型组在模型建立成功后3-、6-、12-和24 h4个时间点随机分为4个亚组。参照Longa等的线栓法制作大鼠MCAO模型；采用本实验室的方法制备HI模型；假手术对照组不插线，不注血。在相应时间点对大鼠进行行为学评分后过量麻醉断头处死，取出完整的脑组织，分别行苏木精-伊红染色和免疫组织化学染色检测、TTC染色测定脑梗死体积、干-湿重法测定脑组织含水量、无机磷法测定Na+,K+-ATP酶活性、RT-PCR测定Ngb、Na+，K+-ATP酶α1亚基、α3亚基mRNA表达。 结果：1 脑组织含水量测定：MCAO组脑组织含水量于12 h开始升高(82.72±1.02)％，24 h显著升高(85.36±1.23)％。HI组水肿在12 h时即显著升高(85.28±0.64)％，较假手术组有显著性差异，并持续到24 h(85.19±0.96)％(P＜0.01)。Hemin干预组脑组织含水量12 h(81.27±1.25)％开始升高，至24 h含水量较MCAO组(85.36±1.23)％和HI组(85.19±0.96)％差异均有显著性(P＜0.011。 2.脑梗死体积测定：缺血6 h时梗死体积明显增大，至24 h梗死体积达到最大。与MCAO组和HI组比较，Hemin处理组在缺血6 h后脑梗死体积差异均有显著性(P＜0.01)，MCAO组和HI组之间比较，梗死体积无明显变化。 3.Na+,K+-ATP酶活性测定：HI组Na+，K+-ATP酶活性自3 h(2.809±0.346)U/mgprot开始较MCAO组(4.565±0.776)U/mgprot、Heroin干预组(5.539±1.366)U/mgprot和1段手术组(5.612±0.615)U/mgprot差异均有显著性(P＜0.01)。缺血24 h Hemin干预组(4.793±1.310)U/mgprot较MCAO组(3.002±0.442)U/mgprot和HI组(2.162±0.101)U/mgprot差异均有显著性(P＜0.05)，与假手术组比较无明显差异。 4 脑组织切片HE染色观察：假手术组及各缺血模型组早期脑组织很少炎细胞浸润。脑梗死后6 h神经元细胞水肿，病变周围少量炎细胞浸润，12 h梗死周围及炎细胞浸润开始增多，24 h可以见到大量以中性粒细胞为主的炎性细胞。HI组可见梗死中心区血肿，大量的含铁血黄素使细胞呈黄色或棕色，脑组织水肿、坏死，可见炎细胞浸润。Hemin处理组显示轻度缺血水肿改变，缺血范围减小，染色无明显变淡。 5 脑组织Ngb免疫组织化学结果：MCAO组、HI组缺血区Ngb阳性神经元数量较Hemin处理组对应区域减少。m组早期Ngb阳性细胞数较MCAO组有一过性升高。随着缺血时间的延长，正常形态结构的阳性细胞数减少，至缺血24 h，Ngb阳性细胞几乎无表达。 6 Ngb mRNA、Na+，K+-ATP酶α1亚基、α3亚基表达：缺血6 h后Ngb mRNA的表达在各组之间比较差异均有显著性(P＜0.01)。6 h时MCAO组Ngb mRNA的表达(0.294±0.031)较其他各组差异均有显著性(P＜0.01)。Hemin干预组的表达变化不明显，至24 h仍显著高于MCAO组(0.396±0.032)(P＜0.01、)。HI组在6 h短暂升高(0.518±0.034)N降低(0.439±0.114)，但与MCAO组比较差异仍有显著性(P＜0.01)。 Na+，K+-ATP酶α1亚基的表达在缺血模型组中无显著性变化，但较假手术组差异均有显著性(P＜0.01)；仅在缺血12h时，HI组(0.708±0.009)α1亚基mRNA表达显著升高，与MCAO组和Hemin干预组比较差异有显著性(P＜0.01)。α3亚基mRNA在缺血6 h时MCAO组的表达(0.774±0.136)显著高于Hemin干预组(0.537±0.071)(P＜0.05)，12 h时(0.440±0.072)较Hemin干预组(0.624±0.103)显著减少(P＜0.05)，至24 h两组之间无显著差异，但较假手术组差异均有显著性(P＜0.05)。HI组较MCAO组和Hemin干预组间差异无显著性。结论：1 Hemin干预后Ngb在mRNA和蛋白水平表达增加。 2.Hemin干预组脑水肿减轻，脑梗死体积减小，Na+，K+-ATP酶活性升高，可能与Ngb表达增多有关。 3.Na+，K+-ATP酶α3亚基mRNA的表达与Na+，K+-ATP酶活性变化趋势相似，可能由于α3亚基对缺血更为敏感，Na+，K+-ATP酶主要通过α3亚基的变化调节来其活性。 4 HI组也可见Ngb表达增多，却表现脑水肿加重，Na+，K+-ATP酶活性减低，可能是由于血肿中血红蛋白分解产物高铁血红素刺激Ngb表达的同时，血肿释放的炎症因子等其他化学物质导致继发性脑损伤，加重了原有病情。

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综述 脑红蛋白与缺血氧性脑损伤

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