携带HCC表位的HBc-VLPs的制备及其负载的DCs诱导抗原特异的细胞免疫应答和抗肿瘤效应的研究

摘要

目的： 肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)是一种常见的恶性肿瘤，其发病率很高，严重威胁人类健康。HCC起病隐匿，发生发展迅猛，手术切除率和术后生存率均较低，所以一直以来它的临床疗效和预后均不理想。目前在手术、化疗、放疗之后辅以免疫治疗越来越受到医学界的重视。但是，肿瘤的低免疫原性和机体对肿瘤的低免疫反应性，使得免疫治疗的应用受到限制。目前，树突状细胞(dentritic cells，DCs)的免疫呈递作用在提高机体对肿瘤的免疫反应中得到进一步认识，尤其是DCs细胞在快速诱导CD8+T细胞免疫记忆形成、通过分泌特定细胞因子抑制CD4+CD25+T细胞的功能及诱导针对非优势抗原表位免疫应答等方面占有优势，因而DCs细胞己成为研发肿瘤疫苗的一个热点，所以研制一种有效的肝癌DC疫苗来激发机体的细胞和体液免疫应答以达到控制此类疾病的目的是疫苗学急需解决的问题。 但是随着对肿瘤免疫治疗研究的不断深入，人们逐渐认识到，肿瘤细胞可通过自身的一些代谢产物使荷瘤宿主体内DCs的数量、表型及其功能发生异常变化，从而抑制DCs的成熟和抗原递呈功能，使机体抗肿瘤免疫受到抑制，使肿瘤细胞得以逃逸免疫系统的监视作用。目前许多研究者应用肿瘤抗原，如肿瘤特异性抗原、肿瘤相关性抗原及完全细胞性抗原体外冲击致敏DCs，使其避开肿瘤的抑制作用，把经过修饰的DCs疫苗输回体内，结果可以有效激发机体产生较强的抗肿瘤免疫应答，但免疫应答一般不能维持。近期的研究表明，这可能是由于抗原负载后的DCs的抗原递呈能力较弱，或者负载抗原后DCs的寿命降低，因此很难诱导长效的T细胞应答。病毒样颗粒(virus-like particles，VLPs)是不含病毒核酸的空壳结构，许多病毒结构蛋白都具有自动组装成VLPs的能力。它在形态结构上与天然的病毒颗粒相似，具有很强的免疫原性和生物学活性。由于VLPs不含有病毒遗传物质，因此不具有感染性，其中有些已经作为疫苗成功应用于临床。研究表明，VLPs在没有任何佐剂的情况下即可诱导较强的细胞与体液免疫应答，并可以通过交叉递呈的方式将抗原表位递呈给CD8+T细胞，诱导CTL反应。最重要的是，VLPs在结构上允许外源基因或基因片段的插入而形成嵌合型VLPs并将外源性抗原展示在其表面，这个特点就为人们研究疫苗提供了更加广阔的前景。 黑色素瘤抗原(melanoma antigen，Mage)在正常组织中除睾丸和胎盘组织外均不表达，但在某些恶性肿瘤如肝细胞癌中高度特异表达，其中MAGEl，MAGE3表达最高。甲胎蛋白(AFP)是肝癌细胞分泌性蛋白，也是肝癌的特异性蛋白。本研究选取高表达于HCC的HLA-A2限制的CTL表位MAGE-1第278-286位(KVLEYVIKV)、MAGE-3第271-279位(FLWGPRALV)、AFP第158-166位(FMNKFIYEI)和AFP第542-550位(GVALQTMKL)氨基酸插入至截短的HBcAg(1-144aa)基因羧基端，构建了单表位和多表位嵌合基因至原核表达质粒pET28a，中，在大肠杆菌中进行表达、纯化，得到颗粒性表达产物王IBc-VLPs，负载DCs后作为肝癌的候选疫苗利用}玎LA-A2转基因小鼠对此DC疫苗的免疫效果进行了评价，评价其诱导抗原特异的CD8+T细胞应答和抗肿瘤效应，探索其作为兼具预防和治疗肝细胞癌作用的新型疫苗的可能性。 方法： 1.获得单表位融合基因利用巢式PCR.技术获得四种抗原表位肽M1(MAGE-1278-286aa)、M3(MAGE-3271-279aa)、A1(AFPl58-166aa)和A2(AFP542-550aa)基因，并通过GA连接子将它们分别插入到截短的HBcAg(1-144aa)基因羧基端，得到单表位融合基因HBc-M1、HBc-M3、HBc-A1和HBc-A2。 2.获得多表位融合基因通过PCR的方法得到含有多表位的抗原肽S1(AFPl-Th表位-AFP2)和S2(MAGEl-MAGE3-Th表位)基因，并通过GA连接子将它们分别插入到截短的HBcAg(1-144aa)基因3’末端，得到多表位融合基因HBc-S1和HBc-S2。 3.构建原核表达质粒pET28a-HBc-抗原表位将上述六种融合基因连入原核表达载体pET28a，然后转化BL21(DE3)受体菌，经PCR及抽提质粒双酶切鉴定阳性克隆。抽提阳性克隆的质粒，进行测序。 4.HBc-抗原表位融合蛋白的获得构建好的原核表达质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达，并通过改变IPTG浓度、诱导时间及葡萄糖加入量等条件优化蛋白表达，目的蛋白主要以包涵体形式存在。蛋白经2M、4M、6M尿素梯度洗涤变性后用Ni-NTA亲和层析柱纯化目的蛋白，经复性透析后得到嵌合病毒样颗粒蛋白HBc-VLPs，用SDS-PAGE、Western-blot、ELISA和透射电镜观察等方法分析鉴定嵌合蛋白分子量大小及其抗原性和颗粒性。 5.HBc-VLPs负载的DCs诱导长效CTL活性及抗肿瘤作用研究。 将制备的HBc-VLPs分别与体外培养的小鼠骨髓来源的DCs共孵育，做细胞涂片并行细胞免疫荧光化学染色，用激光共聚焦显微镜观察DCs胞浆内摄入的蛋白颗粒；通过混合淋巴细胞反应(MLR)观察其能否被DCs提呈从而刺激naiveT细胞增殖。利用转基因小鼠荷瘤模型，对HBc-VLPs负载的DC疫苗抑瘤作用及对小鼠抗原特异性淋巴细胞的IFN-γ分泌和CTL活性进行了观察，并与抗原肽负载的DC疫苗进行了对比。 结果： 构建6种HBV嵌合型颗粒蛋白的原核表达载体pET28a-HBc-A1、pET28a-HBc-A2、pET28a-HBc-M1、pET28a-HBc-M3、pET28a-HBc-S1和pET28a-HBc-S2，其中3种目的蛋白HBc-A1、HBc-Ml和HBc-M3在大肠杆菌中以包涵体形式获得表达。经过梯度尿素洗涤，目的蛋白主要溶于6M尿素中，再经Ni-NTA亲和层析纯化和复性后，蛋白纯度达90％以上。经透射电镜观察发现嵌合蛋白HBc-A1、HBc-M1和HBc-M3均具有病毒样颗粒的结构，Westem-blot和ELISA证实嵌合蛋白保留了HBc抗原性。 此外，3种HBc-VLPs分别与体外培养5天的小鼠BMDCs共孵育后，激光共聚焦显微镜即可观察到DCs胞浆内有摄入的蛋白颗粒。进一步通过混合淋巴细胞反应(MLR)还观察到，VLPs与DCs共培养24h，可以强烈刺激naive T细胞增殖。因此，包涵体变性蛋白经复性可以得到正确折叠的、结构完整的VLPs，且可以被DCs摄取和有效递呈。在分析HBc-VLPs负载DCs的免疫效果时发现，HBc-VLPs负载的DCs免疫小鼠后第8天，流式细胞仪即可检测到分泌IFN-γ的CD8+T细胞存在，用LDH法检测到较强的抗原特异性CTL活性。小鼠荷瘤实验的结果也说明，给荷瘤B16-pIR-HH5天的小鼠，用HBc-VLPs负载的DCs免疫后，在肿瘤接种的20天之前均未见到明显的肿瘤块，而阴性对照组小鼠的肿瘤生长很快，且小鼠死亡率高(荷瘤存活鼠为1/6)，但在荷瘤的20d后，实验组小鼠的肿瘤开始生长。 结论： 1.本研究建立了携带HCC抗原表位的HBc-VLPs的构建、原核表达、纯化的系列技术平台。 2.利用从原核表达系统得到的携带HCC抗原表位的HBc-VLPs负载DCs，得到可强烈诱导机体免疫应答和明显抗肿瘤作用的DCs疫苗。 3.利用HLA-A2转基因小鼠成功制备了可评价HLA-A2限制的CTL表位的小鼠荷瘤模型。 4 本研究结果为DCs疫苗的优化和评价提供了实验方法，也为进一步深入研究新型肝细胞癌治疗性疫苗的功能和应用奠定了基础。

目录

声明

摘要

引言

第一部分携带HCC表位的HBc-VLPs的制备

前言

材料与方法

结果

附表

附图

讨论

结论

参考文献

第二部分HBc-VLPs负载的DC疫苗诱导抗原特异的细胞免疫应答和抗肿瘤效应的研究

前言

材料和方法

结果

附图

讨论

结论

参考文献

综述 病毒样颗粒疫苗的研究进展

致谢

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