蛋白质巯基亚硝基化NO抑制大鼠滑膜细胞RSC-364 CREB和STAT-1活性中的作用

摘要

类风湿性关节炎(RA)是一种以滑膜组织增生和关节炎症反应为病理特征的慢性自身免疫性疾病。成纤维细胞样滑膜细胞(FLS)是滑膜组织的主要组成细胞，在RA患者的病变关节内过度增殖并侵入邻近组织，同时生成大量细胞因子和趋化因子引起局部炎症细胞的聚集和活化，在炎症的起始和持久化以及关节结构的破坏过程中起重要作用。有研究发现，在RA患者关节滑液中，NO含量增高，可诱导FLS凋亡并抑制其增殖，提示在RA发病过程中FLS所处的关节腔内环境中有NO存在，NO在调节FLS功能方面可能发挥重要作用。 本文采用biotin switch method和Western blotting法相结合检测成纤维细胞样滑膜细胞RSC-364蛋白质亚硝基化水平；利用电泳迁移率改变分析(EMSA)技术观察蛋白质亚硝基化对CREB和STAT-1活性的调节作用；同时采用Western blotting方法检测亚硝基化作用对CREB和STAT-1磷酸化水平的影响；并进一步研究亚硝基化对CREB和STAT-1启动的下游基因蛋白表达的调节作用，以探讨蛋白质巯基亚硝基化在RA发病中的调控作用，为揭示NO快速调节效应提供实验依据。 1.NO对RSC-364细胞蛋白质亚硝基化水平的影响 1.1 NO与RSC-364细胞提取的总蛋白直接作用后对亚硝基化水平的影响 本部分实验提取RSC-364总蛋白与NO供体直接孵育，采用biotinswitch method结合Western blotting对RSC-364细胞总蛋白亚硝基化水平进行探索性研究。 方法：提取RSC-364细胞总蛋白进行细胞外亚硝基化反应。将蛋白分为四组：①对照组②还原型谷胱甘肽(GSH)组⑧NO供体亚硝基化谷胱甘肽(GSNO)组④GSNO+DTT(还原剂)组。各组反应结束后均用丙酮沉淀法除去多余试剂，进行biotin switch method。在biotin switchmethod中以上各组均设无生物素标记组为阴性对照。生物素标记后用Western blotting法检测生物素化蛋白表达水平以反映亚硝基化蛋白表达水平。结果：在标记生物素的四个组中，对照组没有见到清晰的蛋白条带，GSNO组可明显见到一组由低分子量到高分子量的蛋白条带，表明GSNO使RSC-364细胞提取的总蛋白亚硝基化水平增高。与GSNO组相比，GSNO+DTT组亚硝基化反应被显著抑制。与对照组相比，GSH对亚硝基化水平无明显影响。无生物素标记组均在分子量为39KDa和58KDa之间有弱的，光密度一致的内源性生物素化蛋白的表达。小结：本部分实验在细胞外水平证实，GSNO释放的NO可引起RSC-364细胞提取的总蛋白发生亚硝基化修饰。 1.2 NO对RSC-364细胞内蛋白质亚硝基化水平的影响 在第一部分(一)中，我们成功利用biotin switch method结合Westernblotting证实，NO与RSC-364细胞提取的蛋白质直接作用可发生亚硝基化修饰。本部分实验应用GSNO孵育RSC-364细胞或采用细胞因子联合刺激RSC-364细胞，检测细胞内蛋白质亚硝基化水平。 方法：实验分为九组：①对照组I；②GSH组；③GSNO组；④GSNO+DTT组；⑤对照组II；⑥IFN-γ+IL-1β组；⑦iNOS抑制剂氨基胍(aminoguanidine，AG)组；⑧IFN-γ+IL-1β+AG组；⑨IFN-γ+IL-1β+DTT组。各组孵育相应时间后提取细胞总蛋白立即进行biotin switch method，并进一步用Westemblotting法检测亚硝基化蛋白的表达。其中⑤-⑧组在孵育相应时间后，收集细胞培养液上清进行NO含量测定。结果显示如下： (1)GSNO孵育细胞对亚硝基化水平的影响在标记生物素的四个组中，对照组I没有见到清晰条带，GSNO组可明显见到一组由低分子量到高分子量的蛋白条带，表明GSNO孵育细胞后使细胞内蛋白质亚硝基化水平增高。与GSNO组相比，GSNO+DTT组亚硝基化反应被显著抑制。与对照组I相比，GSH对亚硝基化水平无明显影响。无生物素标记组均在分子量为39KDa和58KDa之间有弱的，光密度一致的内源性生物素化蛋白的表达。 (2)IFN-γ和IL-1β联合刺激细胞对细胞内亚硝基化水平的影响在标记生物素的四个组中，对照组II没有见到清晰的条带，IFN-γ、IL-1β联合孵育细胞24h后可明显见到一组由低分子量到高分子量的蛋白条带，表明IFN-γ、IL-1β联合孵育细胞使细胞内蛋白质亚硝基化水平增高。DTT可显著抑制IFN-γ和IL-1β共同孵育引起的亚硝基化反应。同时加入AG也可抑制IFN-γ和IL-1β引起的亚硝基化反应。无生物素标记组均在分子量为39KDa和58KDa之间有弱的，光密度一致的内源性生物素化蛋白的表达。 (3)NO含量检测结果与对照组II(4.34±2.82μm/L)相比，细胞因子联合孵育细胞使培养液上清中NO含量显著增高(30.93±4.8μm/L，p<0.01)，而同时应用iNOS抑制剂AG可逆转IFN-γ与IL-1β的作用(4.7±2.6μm/L，p<0.01)。单独应用AG对培养液上清中NO含量无明显影响(5.4±2.47μm/L,p>0.05)。 以上研究结果表明，外源性应用GSNO可引起RSC-364细胞内发生蛋白质巯基亚硝基化。IFN-γ、IL-β联合应用可诱导RSC-364细胞产生NO增多，并引起RSC-364细胞内发生蛋白质亚硝基化。Biotin switch method可成功应用在RSC-364细胞中检测蛋白质亚硝基化水平。 2蛋白质巯基亚硝基化对RSC-364细胞CREB活性的影响 2.1细胞外亚硝基化修饰对RSC-364细胞CREB活性的影响 在第一部分中，我们证实用NO供体GSNO直接孵育RSC-364细胞总蛋白可引起蛋白质巯基亚硝基化，本部分实验首先采用IL-1β诱导RSC-364细胞CREB活化，然后提取核蛋白，用GSNO对细胞核蛋白直接进行亚硝基化修饰，最后用EMSA法观察亚硝基化修饰对CREB活性的影响。 方法：实验分为六组：①对照组；②IL-1β组；③IL-1β+GSNO组；④IL-1β+GSNO+DTT组；⑤DTT组；⑥IL-1β+DTT组。各组反应结束后立即进行EMSA实验。结果如下：在对照组，RSC-364细胞核内未检测到与特异性寡核苷酸探针结合的CREB。用IL-1β孵育细胞2h后细胞核内CREB活性明显高于对照组(p<0.01)，而用GSNO与核蛋白反应后明显抑制了IL-1β诱导的CREB活性(p<0.01)，GSNO的作用可被DTT所逆转(p<0.01)。DTT单独孵育核蛋白对CREB活性无明显影响(p>0.01)。用同源性寡核苷酸(含CREB结合位点)和异源性寡核苷酸(含AP-2结合位点)作为竞争物证实了DNA-蛋白结合的特异性。小结：本部分实验证实，NO与蛋白质直接作用可通过引起蛋白质巯基亚硝基化，导致CREB发生巯基氧化修饰，可逆性抑制IL-1β诱导的CREB活性。 2.2细胞内亚硝基化修饰对RSC-364细胞CREB活性的影响 我们已经证实，NO与蛋白质直接作用可通过引起亚硝基化，导致CREB发生巯基氧化修饰，抑制IL-1β诱导的CREB活性，同时也表明CREB对依赖NO的巯基氧化修饰具有敏感性。本部分实验采用NO供体或联合应用细胞因子孵育RSC-364细胞，研究细胞内亚硝基化对CREB磷酸化水平和DNA结合活性的影响。方法：实验分为十组：①对照组；②IL-1β组；③GSNO组；④GSNO+IL-1β组；⑤NEM组；⑥NEM+GSNO+IL-1β组；⑦GSNO+IL-1β+DTT组；⑧IL-1β+IFN-γ组；⑨AG+IL-1β+IFN-γ组；⑩AG组。各组于相应时间点提取细胞核蛋白进行EMSA实验检测CREB活性；①-⑥组提取总蛋白进行western blotting实验测定CREB和磷酸化CREB(P-CREB)的表达水平。结果表明：GSNO可通过引起RSC-364细胞内蛋白质亚硝基化，导致CREB发生巯基氧化修饰，并抑制其活性，但对其磷酸化水平无明显影响。细胞因子联合刺激RSC-364细胞可通过诱导内源性NO产生，引起亚硝基化水平升高，导致CREB发生巯基氧化修饰，抑制CREB活性。 3.蛋白质巯基亚硝基化对RSC-364细胞STAT-1活性的影响 4 蛋白质巯基亚硝基化对RSC-364细胞CREB和STAT-1启动的下游基因蛋白表达的影响 结论：如下： 1.NO可通过蛋白质亚硝基化导致CREB和STAT-1发生巯基氧化修饰，抑制二者DNA结合活性和下游基因的表达，这可能是NO在RA发病过程中调节FLS稳态，抑制RA发病进程的机制之一。 2.NO是一种气体信号分子，其产生和消失是短暂的过程，进入细胞不需要特殊通道和受体。本课题证实，NO可通过蛋白质亚硝基化调节转录因子的活性，提示亚硝基化修饰是机体快速反应调节机制，与神经-内分泌等调节机制相比，可能是最快速的应激反应。 3.GSNO广泛分布于包括血液系统在内的多种组织和器官，是NO的储存器和运输载体。本实验证实，GSNO可释放NO进入细胞调节转录因子的活性，提示NO不仅以自分泌和旁分泌还可能以内分泌方式调节细胞稳态。

目录

论文说明：英文缩写

声明

摘要

引言

第一部分一氧化氮对RSC-364细胞亚硝基化水平的影响

一、一氧化氮与RSC-364细胞提取的总蛋白直接作用后对亚硝基化水平的影响

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

二、一氧化氮对RSC-364细胞内蛋白质亚硝基化水平的影响

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第二部分蛋白质巯基亚硝基化对RSC-364细胞CREB活性的影响

一、细胞外亚硝基化修饰对RSC-364细胞CREB活性的影响

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

二、细胞内亚硝基化修饰对RSC-364细胞CREB活性的影响

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第三部分蛋白质巯基亚硝基化对RSC-364细胞STAT-1活性的影响

一、细胞外亚硝基化修饰对RSC-364细胞STAT-1活性的影响

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

二、细胞内亚硝基化修饰对RSC-364细胞STAT-1活性的影响

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第四部分亚硝基化对RSC-364细胞IL-6和IP-10蛋白表达的影响

一、亚硝基化修饰对IL-1β诱导RSC-364细胞IL-6蛋白表达的影响

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

二、亚硝基化修饰对RSC-364细胞IP-10蛋白表达的影响

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

结论

综述一氧化氮的蛋白质巯基亚硝基化与细胞调控

致谢

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