孤束核味觉区脑啡肽和γ-氨基丁酸对味觉信息的调制作用

摘要

孤束核吻侧段(rNST)与味觉信息的传递及整合有密切关系。rNST不仅接受来自于面、舌咽及迷走神经的味觉传入，而且与味觉调控关系密切的核团之间具有往返的纤维联系。rNST内含有多种神经递质和调质。其中，谷氨酸和P物质主要发挥兴奋性调节作用，而脑啡肽(ENK)和γ-氨基丁酸(GABA)主要对味觉感受神经元产生抑制作用。rNST内分布有密集的ENK阳性(ENK-ir)纤维和终末及大量的μ型和δ型阿片受体(MOR和DOR)。GABA阳性(GABA-ir)神经元也大量存在于rNST内。Malanga等发现GABA的活性受到阿片类物质的抑制，而Echo等则证实阿片与GABA存在功能上的协同作用，但其作用机制的形态学基础目前仍未见报道。为此，本研究利用脑立体定位仪并应用光、电镜免疫组织化学方法，对大鼠摄食变化及rNST内ENK-ir与GABA-ir结构之间的相互联系以及MOR-ir神经元与ENK-ir终末的联系进行了观察。 第一部分孤束核内微量注射脑啡肽和γ-氨基丁酸引起大鼠摄食改变的行为学研究 目的: 利用脑立体定位仪向孤束核内微量注射脑啡肽和γ-氨基丁酸，观察大鼠摄食变化。 方法: 1. 测量基础摄食量 SD大鼠22只。分为三组，GABA组10只、ENK组10只和对照组2只。均单笼饲养在消毒后的笼子中，自由进水、饮食，室温22～2℃，12 h光照/黑暗转换。连续喂养5日，以适应环境。并测量累积摄食量。 2. 外科手术 2.1 用2％戊巴比妥钠(45 mg/kg)腹腔麻醉后，将动物头部固定在立体定位仪上，根据Paxinos和Watson图谱经颅骨在rNST将一带芯不锈钢导管插入rNTS上方2.0 mm处(Bregma向尾段12.80mm，中线旁开1.2mm，Bregma点水平向下6mm。Bregma点是大鼠的前囟门位置)手术后，每天给予肌肉注射青霉素20万单位，连续四天，以防伤口和颅内感染。 2.2 脑内注射：动物轻微麻醉后，将一微量注射器针头经导管插入脑内，使其尖端在导管尖端下方2.0 mm处，以到达rNTS(Bregma向尾段12.80mm，中线旁开1.2mm，Bregma点水平向下8mm)。将0.2(每侧)μl的药物或生理盐水缓慢地注入rNTS。 3. 术后测量基础摄食量 在注药后4小时、8小时、12小时按同一方法记录大鼠累积进食量。 4. 注射区的组织学定位 实验结束时，在深度麻醉下，将动物用生理盐水和4％多聚甲醛液中相继经升主动脉进行灌注。取出脑并将其在4％多聚甲醛溶液中后固定1-2 d。用冰冻切片机切成大约60μm厚的切片，HE染色。然后将注射位点按组织学图谱进行组织学定位。 结果: 1. 注药部位检查：切片检查显示，rNST微量注射的部位(即针道的顶端)处于孤束核吻端内，双侧对称。 2. GABA组10只，其中有1只出现了术后感染，弃去不用。从分别在注药后4小时、8小时、12小时测量摄食量，剩余9只与对照组相比，均出现摄食量降低。 3. ENK组10只分别在注药后4小时、8小时、12小时测量摄食量，与对照组相比，均出现摄食量降低。 结论: 分别向孤束核内微量注射GABA和ENK，均可引起大鼠基础摄食量降低，这主要是由于二者均可抑制孤束核内的味觉神经元活性，从而影响大鼠的基础摄食量。 第二部分大鼠延髓孤束核吻侧段内脑啡肽阳性终末与γ-氨基丁酸阳性神经元联系的形态学研究 目的: 观察大鼠孤束核吻侧段(rNTS)内脑啡肽阳性(ENK-ir)终末与γ-氨基丁酸阳性(GABA-ir)神经元之间的联系。 方法: 1. 组织材料的处理 SD大鼠10只。将大鼠在腹腔内注射过量戊巴比妥钠的深麻醉状态下开胸，经升主动脉插管，先用80 ml生理盐水冲净血液，再灌注以500 ml含4％多聚甲醛、0.05％戊二醛和2％苦味酸的0.1 mol/L磷酸缓冲液。灌注完毕立即取脑并置于上述新鲜固定液中后固定4h，再移入含30％蔗糖的0.1 mol/LPB(4℃)内至沉底。将材料切块，分离出低位脑干并切片。 2. 免疫荧光染色法 将光镜组切片置于含小鼠抗ENK(1:500)及兔抗GABA(1:5000)的反应液内(含5％正常山羊血清及0.5％Triton X-100)室温孵育24小时。之后浸入含Biotin标记的绵羊抗小鼠IgG(1:200)的反应液内于室温下孵育8小时。最后入含Texas Red标记的Avidin(1:200)及Fluorescein标记的驴抗兔IgG(1:200)反应液，室温下避光孵育6小时。将上述切片裱于载玻片上，使用SlowFade抗荧光衰减剂封片后于激光扫描共聚焦显微镜(Leica TCS-SP2)下观察。 3. 包埋前染色免疫电镜法 电镜组切片在进行免疫组化染色之前，置于液氮中速冻数秒，放置前、后将切片浸于冰冻保护液中。将切片置于30％正常山羊血清中30 min，之后浸入含小鼠抗ENK(1:500)及兔抗GABA(1:5000)的反应液内(含5％正常山羊血清)，室温孵育24 h。随后浸入含Biotin标记的绵羊抗小鼠IgG(1:200)及纳米金标记的山羊抗兔IgG的反应液内，室温下过夜。在1％戊二醛内固定10 min后将切片用银加强试剂盒进行银加强染色，染色前后使用双蒸水清洗。之后使用ABC复合物孵育2 h并进行常规二氨基联苯胺(DAB)反应。上述各步骤之间均用PBS彻底清洗。随后将经上述免疫组化双重染色的切片置入1％锇酸溶液固定1 h，在70％酒铀中浸泡4 h，梯度酒精及环氧丙烷脱水，Epon-812平板包埋。取rNTS位置的组织片做超薄切片，枸橼酸铅染色后于电镜(H-7500，Hitachi)下观察。 结果: 1. 在激光共聚焦扫描显微镜下 1.1 rNTS内分布着红色标示的ENK-ir结构，以密集分布的终末为主，阳性纤维呈中等密度分布。 1.2 rNTS内分布着绿色标示的GABA-ir结构，以散在分布且直径为10～15μm的小神经元为主，纤维和终末样结构则稀疏地分布于阳性胞体之间。 1.3 部分ENK-ir终末与GABA-ir胞体以及阴性的胞体之间形成密切接触。 2. 在电镜下 2.1 rNTS内存在许多ENK-ir轴突和终末。在ENK-ir终末内，可见DAB反应产物主要沉积于圆形清亮囊泡表面及线粒体等细胞器表面，在部分终末内还可见到阳性的大颗粒囊泡。 2.2 rNTS内存在GABA-ir结构，可见数目及大小不等的黑色金颗粒散在分布于胞体、树突及少量轴突内。GABA-ir产物主要分布于粗面内质网及核糖体表面等结构。 2.3 电镜下可见到ENK-ir轴突终末形成以下突触关系： 2.3.1 与GABA-ir阳性胞体、树突及树突棘形成对称(62％)及非对称性(38％)轴-体(26％)及轴-树(74％)突触。 2.3.2 与GABA-ir阴性的胞体、树突及树突棘形成对称(73％)及非对称性(27％)轴-体(18％)及轴-树(82％)突触； 2.3.3 与GABA-ir阴性的轴突之间还可见到少量对称性轴.轴突触，ENK-ir轴突终末为突触前或后成分。 结论: rNTS内的ENK-ir终末可能通过抑制或增强GABA能神经元活性或者直接抑制味觉感受神经元活性的方式参与NTS内味觉信息的感受和调节。 第三部分大鼠延髓孤束核吻侧段内GABA和MOR共存神经元及ENK阳性终末与MOR阳性神经元联系的实验研究 目的: 观察延髓孤束核吻侧段(rNST)内是否存在γ-氨基丁酸(GABA)与阿片μ受体(MOR)共存的神经元，以及MOR阳性(MOR-ir)神经元与脑啡肽阳性(ENK-ir)终末的突触联系。 方法: 1. 组织材料的处理 SD大鼠22只。将大鼠在腹腔内注射过量戊巴比妥钠(100 mg/kg)的深麻醉状态下灌注，取材。方法同上。 2. 免疫荧光染色法 方法同上。光镜组第一套切片用豚鼠抗MOR(1:500)及兔抗GABA(1:5000)代替原一抗，用Fluorescein标记的驴抗豚鼠IgG(1:500)和Cy3标记的绵羊扰兔IgG(1:500)代替原二抗。光镜组第二套切片用小鼠抗ENK(1:500)及豚鼠抗MOR(1:500)代替原一抗，用Biotin标记的绵羊抗小鼠IgG(1:200)及Texas Red标记的.Avidin(1:200)及Fluorescein标记的驴抗豚鼠IgG(1:500)代替原二抗。余反应步骤同。 3. 包埋前染色免疫电镜法 将电镜组第一套切片用小鼠抗ENK(1:500)及豚鼠抗MOR(1:500)代替原一抗，用Biotin标记的绵羊抗小鼠IgG(1:200)及纳米金标记的山羊抗豚鼠IgG代替原二抗。将电镜组第二套切片用豚鼠抗MOR(1:500)及兔抗GABA(1:5000)代替原一抗，用Biotin标记的绵羊抗兔IgG(1:200)及纳米金标记的山羊抗豚鼠IgG代替原二抗。余反应步骤同。 结论: rNST内的GABA能神经元表达MOR，而ENK-ir终末可能通过与MOR结合调节GABA能神经元的活性，从而参与味觉信息的感受和调节。

目录

论文说明:英文缩写

声明

摘要

引言

第一部分孤束核内微量注射脑啡肽和γ-氨基丁酸引起大鼠摄食改变的行为学研究

前言

材料与方法

结果

附表

附图

讨论

小结

参考文献

第二部分大鼠延髓孤束核吻侧段内脑啡肽阳性终末与γ-氨基丁酸阳性神经元联系的形态学研究

前言

材料与方法

结果

附表

附图

讨论

小结

参考文献

第三部分 大鼠延髓孤束核吻侧段内GABA和MOR共存神经元及ENK阳性终末与MOR阳性神经元联系的实验研究

前言

材料与方法

结果

附表

附图

讨论

小结

参考文献

结论

综述 孤束核味觉区GABA和脑啡肽对味觉信息的调制作用

致谢

个人简历