旋复花(Inula britanica L.)中抑制妇科肿瘤细胞增殖活性化合物的筛选及其作用机制的研究

摘要

目的：菊科旋复花属（Inula L.）植物全世界约有100种，分布于欧洲、亚洲及非洲，以地中海地区为主，我国有20余种。旋复花为菊科的多年生草本植物，是一种传统的中草药，多年来一直用于治疗胃肠炎、支气管炎及结核性腹泻等。目前报道旋复花的化学成分主要有黄酮类、倍半萜内酯类和萜类化合物，其中证明有药理活性的成分大多数为倍半萜内酯类化合物，具有抗炎、抗肝损伤、抗肿瘤和细胞毒等作用，对糖尿病也有疗效。本实验以人子宫颈癌细胞株（HeLa）、人子宫内膜癌细胞株（HEC-1）、人卵巢透明癌细胞株（SHIN-3）、人卵巢透明癌细胞株（HOC-21）和人卵巢囊腺癌细胞株（HAC-2）为材料，研究旋复花中化合物异土木香内酯、1-氧-乙酰大花旋复花内酯和大花旋复花内酯对这5种妇科肿瘤细胞的体外生长的抑制作用，并进一步探讨旋复花中单体化合物异土木香内酯抗HeLa细胞增殖的作用机制。
　　 方法：
　　 1.MTT（四甲基偶氮唑蓝）比色法
　　 1.1肿瘤细胞株悬液制备
　　 用RPMI1640完全培养基调整HeLa等肿瘤细胞株浓度为2×105个/mL的细胞悬液备用。
　　 1.2实验用化合物的体外抑瘤实验
　　 将HeLa肿瘤细胞株悬液接种于96孔培养板，每孔50μL，分别加入空白对照磷酸盐缓冲液、溶剂对照0.05％二甲基亚砜、阳性对照顺铂（DDP）以及1μmol/L、10μmol/L、100μmol/L单体化合物各50μL，每组均设3个复孔。置于培养箱中培养48 h，于培养结束前4 h，各培养孔加入5 mg/mL四甲基偶氮唑蓝（MTT）10此，培养4～6 h后，弃去培养上清，每孔加入反应停止液150μL，振荡10 min，使结晶充分溶解，用酶联免疫检测仪检测各孔吸光度（OD）值，测定波长λ=570nm，参考波长λ=620 nm，并计算肿瘤细胞生存率。
　　 1.3活性化合物的广谱抗肿瘤细胞增殖活性实验
　　 选择具有活性的单体化合物，考察活性化合物对人子宫内膜癌细胞株（HEC-1）、人卵巢透明癌细胞株（SHIN-3和HOC-21）和人卵巢囊腺癌细胞株（HAC-2）的增殖的抑制作用。
　　 2.流式细胞仪及Annexin V-FITC试剂盒分析细胞凋亡
　　 细胞传代进入对数生长期，实验组加入12.5μmol/L的异土木香内酯，空白对照组加入磷酸盐缓冲液，于培养48 h后收集细胞，用4℃预冷的PBS洗细胞两次，用250μL结合缓冲液重新悬浮细胞，调解其浓度为1×106/mL，取100μL的细胞悬液于5 mL流式管中，加入5μL.AnnexinV/FITC和10μL20μg/mL的碘化丙锭溶液，混匀后于室温避光孵育15 min，在反应管中加400μL稀释好的结合缓冲液，及时上流式细胞仪分析。
　　 结果：
　　 1.MTT（四甲基偶氮唑蓝）比色法结果
　　 旋复花中化合物具有明显的抑制妇科肿瘤细胞增殖活性，异土木香内酯、1-氧-乙酰大花旋复花内酯和大花旋复花内酯对HeLa、HEC-1、SHIN-3、HOC-21、HAC-2细胞增殖有不同的抑制活性。其中异土木香内酯对HeLa、HEC-1、HOC-21、HAC-2细胞的增殖显示较强的抑制活性，异土木香内酯用1μmol/L、10μmol/L和100μmol/L处理HeLa细胞，其生存率分别为91.81％、66.67％和18.65％，对HEC-1细胞生存率的影响分别为92.96％、68.67％和33.96％，对HOC-21细胞生存率的影响分别为83.57％、73.37％和20.72％，对HAC-2细胞生存率的影响分别为85.62％、49.75％和20.53％，均呈现较好的剂量依赖关系，并且该化合物100μmol/L组与空白对照组相比均具有非常显著性的差异（P<0.01），半数抑制浓度（IC50）分别约为17.67μmol/L、32.74μmol/L、19.65μmol/L和11.49μmol/L。
　　 2.流式细胞仪及Annexin V-FITC试剂盒分析细胞凋亡结果
　　 异土木香内酯以12.5μmol/L处理HeLa细胞，于48 h后进行Annexin-V/PI染色，流式细胞仪检测，结果显示HeLa细胞早期凋亡率为（40.75±5.16）％，PBS组为（3.47±3.82）％，异土木香内酯12.5μmol/L浓度组与PBS组相比，具有显著性差异（P<0.05）。流式细胞检测进一步证实异土木香内酯具有明显诱导HeLa细胞发生凋亡的活性。
　　 结论：旋复花中化合物具有明显的抑制妇科肿瘤细胞增殖活性；异土木香内酯抑制HeLa细胞增殖作用有可能是通过促细胞凋亡机制而实现的。肿瘤的发生和细胞增殖与凋亡平衡失调有关。细胞凋亡与肿瘤的发生、发展和退化密切相关。诱导肿瘤细胞凋亡是近年肿瘤治疗研究的一个新靶点。旋复花中化合物对于体外人子宫颈癌细胞株、人子宫内膜癌细胞株以及人卵巢癌细胞株具有高效、特异的杀瘤效应。随着对宫颈癌、子宫内膜癌发病机制及卵巢癌化疗药物耐药机制认识的进一步加深，妇科肿瘤的治疗迈上了一个新的台阶。旋复花中化合物为宫颈癌、子宫内膜癌及耐药性卵巢癌，提供了一个新的治疗策略，是目前化学预防和治疗肿瘤研究的热点之一，有希望成为一种具有广泛应用前景的抗癌新药。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

参考文献

综述 倍半萜化合物的生物活性研究进展

致谢

个人简历