RNA干扰技术阻断黏着斑激酶表达对肝星状细胞胶原代谢的影响

摘要

肝硬化是威胁人类健康的常见病和多发病，而肝纤维化是肝硬化形成的共有病理改变和必经途径。因此，如何阻止或逆转肝纤维化是治疗各种慢性肝病、预防肝硬化的关键。
　　 肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSC）是肝脏合成胶原的最主要细胞；HSC活化、增殖、迁移进而合成大量的胶原等细胞外间质（extracellular matrix，ECM）成分是肝纤维化形成的中心环节。
　　 黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）在整合素介导的信号转导中发挥关键作用。研究显示，FAK磷酸化后与多种器官组织纤维化疾病有关，在肝纤维化的发生发展过程中亦发挥重要作用。我们的前期研究表明，胆总管结扎大鼠纤维化肝组织中FAK表达增强，FAK磷酸化后可以促进HSC的胶原合成，且在体外运用质粒转染方法使外源性黏着斑激酶相关非激酶（FAK related non-kinase，FRNK）在HSC过表达，可以抑制HSC的胶原合成。因此，我们推测抑制体内FAK的活化和表达可能成为逆转肝纤维化的新靶点和新方向。
　　 RNA干扰（RNA interference，RNAi）能高效特异地抑制靶基因的转录，进而下调相应蛋白水平及功能，是目前研究基因功能和信号转导通路的最有力工具。
　　 为此，我们采用RNAi技术，在阳离子聚合物介导下将干扰质粒瞬时转染HSC，进一步研究特异性阻断FAK表达对纤维连接蛋白（fibronectin，FN）刺激的HSC胶原代谢的影响及其机制，为肝纤维化的治疗提供理论依据。
　　 目的：应用FAK shRNA质粒转染HSC，探讨特异性阻断FAK表达对FN刺激的HSCⅠ、Ⅲ型胶原表达的影响，以及该过程中MMP-13、TIMP-1、MMP-2、TIMP-2和MT1-MMP的表达变化。
　　 方法：应用体外细胞培养技术，在阳离子聚合物介导下瞬时转染FAK shRNA质粒，实验分为五组：①空白对照组（简写为Con）；②FN刺激组（简写为FN）；③转染试剂组（简写为Sofast）；④阴性对照组pEGFP-HK（简写为HK组）；⑤pEGFP-FAK shRNA干扰组（简称为FAK shRNA组）。②～⑤组中FN浓度均为10μg·mL-1。采用荧光显微镜及流式细胞术检测转染效率，采用Western blot和real-time Q-PCR技术检测FAK shRNA质粒转染前后FAK与Ⅰ型胶原的蛋白和mRNA表达；real-time Q-PCR技术检测FAK shRNA质粒转染前后Ⅲ型胶原mRNA表达情况；Western blot和real-time Q-PCR技术检测MMP-13、TIMP-1、MMP-2、TIMP-2和MT1-MMP表达。
　　 结果：①转染后48 h，利用荧光显微镜及流式细胞术证实转染成功，转染效率约40％； Western blot分析，FAK shRNA转染后48 h，可显著下调FAK蛋白的表达，蛋白下调率为72.53％； real-timeQ-PCR结果显示FAK shRNA下调FAK mRNA的表达，FAK shRNA转染HSC24 h后下调率为76.73％；②FAK shRNA抑制Ⅰ型胶原mRNA和蛋白的表达：real-time Q-PCR结果显示，与HK组相比，FAK shRNA组Ⅰ型胶原mRNA表达明显减少，最高下调点出现于FAKshRNA质粒转染HSC后36 h（0.69±0.03 vs1.96±0.15），下调率为64.80％； Western blot结果显示FN组Ⅰ型胶原蛋白的合成显著高于Con组，FAK shRNA组Ⅰ型胶原蛋白表达同HK组相比显著下降，最高下调点出现于FAK shRNA质粒转染HSC后48 h（0.85±0.03vs2.58±0.21），下调率为67.05％；③FAK shRNA抑制Ⅲ型胶原mRNA的表达：real-time Q-PCR结果显示在转录水平上，FN组Ⅲ型胶原的合成显著高于Con组，FAK shRNA组Ⅲ型胶原的合成同HK组相比显著下降，最高下调点出现于FAK shRNA质粒转染HSC后36h（0.59±0.07 vs1.62±0.12），下调率为63.58％；④FAK shRNA上调MMP-13 mRNA和蛋白的表达：real-time Q-PCR和Western blot结果显示在转录和翻译水平上，FN组MMP-13的表达显著低于Con组，而FAK shRNA组MMP-13 mRNA和蛋白的表达较HK组显著增加，最高上调点分别出现于FAK shRNA质粒转染HSC后36 h和48 h（1.24±0.04 vs0.79±0.03，1.74±0.20 vs1.09±0.09），上调率分别为56.96％和59.63％；⑤FAK shRNA抑制TIMP-1mRNA和蛋白的表达：real-time Q-PCR和Western blot结果显示在转录和翻译水平上，FN组TIMP-1的表达显著高于Con组，而FAK shRNA组TIMP-1的表达较HK组显著下降，最高下调点分别出现于FAK shRNA质粒转染HSC后36 h和48 h（0.49±0.02 vs1.72±0.10，0.76±0.08 vs2.31±0.24），下调率分别为71.51％和67.10％；⑥FAK shRNA下调TIMP-1/MMP-13比值：无论是在转录水平还是在翻译水平上，FN组TIMP-1/MMP-13比值均较Con组升高，P<0.05，但与Sofast组、HK组比较无明显差异，P>0.05，FAK shRNA组TIMP-1/MMP-13比值明显低于HK组，最高下调点分别出现于FAK shRNA质粒转染HSC后36h和48 h（0.42±0.03vs2.19±0.17，0.44±0.01 vs2.11±0.05），下调率分别为80.82％和79.15％；⑦FAK shRNA上调MT1-MMP mRNA和蛋白的表达：在转录和翻译水平上，FN组MT1-MMP的表达均显著低于Con组，而FAK shRNA组MT1-MMP mRNA和蛋白的表达较HK组显著增加，最高上调点分别出现于FAK shRNA质粒转染后36 h和48 h（1.41±0.08 vs0.85±0.04，1.72±0.10 vs1.06±0.12），上调率分别为65.88％和62.26％；⑧FAK shRNA上调MMP-2 mRNA和蛋白的表达：在转录和翻译水平上，FN组MMP-2的表达显著低于Con组，而FAK shRNA组MMP-2 mRNA和蛋白的表达较HK组显著增加，最高上调点分别出现于FAK shRNA质粒转染HSC后36h和48 h（1.36±0.06 vs0.82±0.02，1.33±0.05 vs0.80±0.05），上调率分别为65.85％和66.25％；⑨FAKshRNA抑制TIMP-2 mRNA和蛋白的表达：在转录和翻译水平上；FN组TIMP-2的表达显著高于Con组，FAK shRNA组TIMP-2 mRNA和蛋白的表达较HK组显著下降，最高下调点分别出现于FAK shRNA质粒转染HSC后36 h和48 h（0.73±0.03 vs1.54±0.04，0.53±0.08 vs1.31±0.02），下调率分别为52.60％和59.54％；⑩FAK shRNA下调TIMP-2/MMP-2比值：无论是在转录水平还是在翻译水平上，FN组TIMP-2/MMP-2比值较Con组升高，FAK shRNA组TIMP-2/MMP-2比值显著低于HK组，最高下调点分别出现于FAK shRNA质粒转染HSC后36h和48 h（0.54±0.05 vs1.88±0.08，0.40±0.05 vs1.64±0.13），下调率分别为71.28％和75.61％。
　　 结论：在阳离子聚合物介导下瞬时转染靶向FAK的shRNA质粒，可有效抑制FAK的表达，并可以抑制FN刺激的HSCⅠ、Ⅲ型胶原的合成，此可能与抑制FAK的表达可以下调TIMP-1和TIMP-2的表达，上调MMP-13、MT1-MMP和MMP-2的表达，从而调节TIMP-1/MMP-13和TIMP-2/MMP-2的比值有关。

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结论

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综述 黏着斑激酶与纤维化

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