盐酸小檗碱联合抗真菌药物对犬小孢子菌体外抗菌活性研究

摘要

目的：儿童白癣发病呈世界范围性分布，因地理位置、气候环境、生活习惯等的不同，发病率也存在差异。近期研究显示在欧洲大部分地区和我国内陆（除新疆外）其致病菌种主要为犬小孢子菌。治疗犬小孢子菌引起的头癣，有效药物包括灰黄霉素、伊曲康唑和特比萘芬等，各种药物治疗疗程和疗效报道不一。为降低传统药物的毒副作用，提高疗效，国内外学者多主张采用联合用药。徐铮等人报道小檗碱与氟康唑、酮康唑、咪康唑等抗真菌药合用，能不同程度地提高真菌感染的治疗效果，并能使抗真菌药物恢复对耐药真菌的作用，因此可用作抗真菌药物的增效剂。已有学者报道应用粗提盐酸小檗碱有抗皮肤癣菌的作用，但应用盐酸小檗碱纯品联合抗真菌药对犬小孢子菌进行体外抗菌活性研究至今尚未见报道。
　　 到目前为止，对于皮肤癣菌的药敏标准方案和对结果耐药及敏感标准的界定尚无统一标准。本次实验参照美国国家临床和实验室标准化研究所（CLSI）推荐的《产孢丰富丝状真菌微量液基稀释法抗真菌药敏试验方案》（M38-A）和相关文献，采用微量稀释祛测定盐酸小檗碱单独及联合应用临床常用的三种抗真菌药物对从临床分离的30株犬小孢子菌进行体外药敏试验，并对不同浓度联合应用的抗真菌活性进行比较，以进一步探讨最优联合方案。
　　 方法：
　　 1.菌种分离、培养及鉴定：菌株分离自2007年9月至2008年10月就诊于河北医科大学第二医院皮肤科门诊的头癣患者。用镊子拔除病发和周边鳞屑，若真菌镜检阳性，同时做培养。接种于含氯霉素的沙氏葡萄糖蛋白胨琼脂培养基，每例标本同时作2管培养，（25-27）℃培养（2-4）周；观察菌落生长情况并涂片镜检为皮肤癣菌时，转种于米饭培养基上，同时做小培养以鉴定菌种。
　　 2.体外药敏实验
　　 2.1单独抗真菌药物药敏实验：
　　 用移液器将2倍药物终浓度抗真菌药物倍比稀释液依次加入96孔细胞培养板的每行第1至第10列孔中，每孔加入100uL，第11列和第12列加入RPMI1640培养基100uL。将菌悬液用RPMI-1640液体培养基稀释50倍，得到（0.4～5）×104 CFU/ mL的2倍终浓度的菌悬液。96孔细胞培养板的每行第1至第11列孔中加入100uL菌悬液，第12列加入100uL培养基。28℃恒温培养，于第5天判读结果。
　　 2.2盐酸小檗碱等量联合抗真菌药物药敏实验：
　　 上述浓度的盐酸小檗碱和抗真菌药物各50uL加入96孔细胞培养板第1至10列。余操作同单独药敏实验。28℃恒温培养，于第5天进行结果判读。
　　 2.3盐酸小檗碱交叉联合抗真菌药物药敏实验：
　　 用微量移液器将药物加入96孔细胞培养板内，其中第1至第8行的第1列（孔）至第10列（孔），从高浓度到低浓度，依次加入盐酸小檗碱系列药液各50μL；第1列至第10列的第1行（孔）至第8行（孔）为抗真菌药物第3至第10个倍比稀释浓度的系列药物各50μL，余同单独抗真菌药物药敏实验。28℃恒温培养，培养5天判读结果。
　　 3.统计学方法：所得数据经SPSS11.5软件进行统计学处理。不同抗真菌药物MIC值比较经秩转换后用单因素方差分析；盐酸小檗碱和抗真菌药物联合抗菌FIC值用X2检验；进一步两两比较用X2分割法检验。P<0.05有统计学意义。
　　 结果：
　　 1.四种药物对犬小孢子菌体外药敏实验结果：灰黄霉素、伊曲康唑、特比萘芬、盐酸小檗碱最低抑菌浓度（MIC）值几何均数依次为：0.9117ug/ml，0.5236ug/ml，0.0050ug/ml，4.5920ug/ml，四种抗真菌药物MIC值比较经秩转换后用单因素方差分析，差异无统计学意义。
　　 2.盐酸小檗碱分别与灰黄霉素、伊曲康唑、特比萘芬等量联合FIC值结果：FIC<1所占比例分别为26.7％（8/30）、46.7％（14/30）、43.3％（13/30）；1≤FIC<2所占比例分别为33.3％（10/30）、20.0％（6/30）、23.30％（7/30）；FIC≥2所占比例分别为40.0％（12/30）、33.3％（10/30）、33.3％（10/30），总体比较经X2检验，差异无统计学意义。
　　 3.盐酸小檗碱和三种抗真菌药物交叉联合抗菌FIC结果：
　　 3.1不同浓度盐酸小檗碱和灰黄霉素联合抗菌结果：盐酸小檗碱各浓度分别和8ug/ml、4ug/ml、2ug/ml、1ug/ml、0.5ug/ml、0.25ug/ml灰黄霉素交叉联合所得FIC<1所占比例分别为：3.3％（1/30）、20.0％（6/30）、40.0％（12/30）、50.0％（15/30）、43.3％（13/30）、50.0％（15/30）：1≤FIC<2所占比例分别为：20.0％（6/30）、36.7％（11/30）、33.3％（10/30）、33.3％（10/30）、40.0％（12/30）、33.3％（10/30）； FIC≥2所占比例分别为：76.7％（23/30）、43.3％（13/30）、26.7％（8/30）、16.7％（5/30）、16.7％（5/30）、16.7％（5/30）：经X2检验，差异有统计学意义。进一步两两比较结果为：灰黄霉素8ug/ml组分别和2ug/ml、1ug/ml、0.5ug/ml、0.25ug/ml组比较P<0.0031，差异均有统计学意义。其余任何两组比较均无统计学差异。
　　 3.2不同浓度盐酸小檗碱和伊曲康唑联合抗菌结果：盐酸小檗碱各浓度分别和2ug/ml、1ug/ml、0.5ug/ml、0.25ug/ml、0.125ug/ml、0.0625ug/ml伊曲康唑交叉联合所得FIC<1所占比例分别为：33.3％（10/30）、50.0％（15/30）、60.0％（18/30）、60.0％（18/30）、53.3％（16/30）、56.7％（17/30）；1≤FIC<2所占比例分别为：26.7％（8/30）、36.7％（11/30）、26.7％（8/30）、30.0％（9/30）、33.3％（10/30）、36.7％（11/30）；FIC≥2所占比例依次为：40.0％（12/30）、13.3％（4/30）、13.3％（4/30）、10.0％（3/30）、13.3％（4/30）、6.7％（2/30）；经X2检验，差异无统计学意义。
　　 3.3不同浓度盐酸小檗碱和特比萘芬联合抗菌结果：盐酸小檗碱各浓度分别和特比萘芬0.04ug/ml、0.02ug/ml、0.01ug/ml、0.005ug/ml、0.0025ug/ml、0.00125ug/ml、0.000625ug/ml、0.000313ug/ml浓度组交叉联合实验所得FIC<1所占比例依次为10.0％（3/30）、30.0％（9/30）、36.7％（11/30）、40.0％（12/30）、50.0％（15/30）、40.0％（12/30），33.3％（10/30）、40.0％（12/30）；1≤FIC<2所占比例依次为26.7％（8/30）、20.0％（6/30）、33.3％（10/30）、30.0％（9/30）、33.3％（10/30）、30.0％（9/30），36.7％（11/30）、30.0％（9/30）； FIC≥2所占比例依次为63.3％（19/30）、50.0％（15/30）、30.0％（9/30）、30.0％（9/30）、16.7％（5/30）、30.0％（9/30），30.0％（9/30）、30.0％（9/30）。经X2检验，差异无统计学意义。
　　 结论：
　　 1.盐酸小檗碱、灰黄霉素、特比萘芬、伊曲康唑对临床分离犬小孢子菌都有很好的体外抗菌活性。
　　 2.盐酸小檗碱联合应用灰黄霉素、特比萘芬、伊曲康唑体外有协同抗犬小孢子菌活性作用，协同作用与联合浓度有关。盐酸小檗碱与低浓度灰黄霉素、特比萘芬联合协同作用较强。
　　 3.盐酸小檗碱与伊曲康唑联合协同作用最强，盐酸小檗碱与灰黄霉素联合协同作用最弱。

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结果

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结论

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综述 盐酸小檗碱药代动力学及体外抗犬小孢子菌药敏实验研究

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