蕨麻正丁醇部位对大鼠心肌缺血再灌注损伤保护作用的蛋白组学研究

摘要

目的：研究蕨麻正丁醇部位对大鼠结扎冠状动脉所致急性心肌缺血再灌注损伤的保护作用及其蛋白表达差异的影响，进而探讨蕨麻正丁醇部位心肌保护作用的药理机制。
　　 方法：选取雄性SD大鼠随机分为手术对照组，模型组，蕨麻正丁醇部位49.3mg.kg-1，98.6mg·kg-1，197.2m g·kg-1干预组，复方丹参328.6mg·kg-1干预组。手术对照组给予3‰羧甲基纤维素（CMC），连续灌胃14天，通过结扎大鼠冠状动脉左前降支建立急性心肌缺血再灌注模型。测定各处理组动物心电图的变化；取心肌组织进行常规HE染色；取血清检测LDH、CK、SOD活性及MDA含量；透射电镜检测急性心肌缺血再灌注损伤以后心肌细胞超微结构的变化；提取各组心肌组织蛋白，经双向电泳和银染得到双向电泳图谱，用PDOuest7.0软件进行图像分析；考马斯亮蓝染色后，取蛋白点进行酶解，再用MALDI-TOF-MS进行分析，使用Mascot软件在NCBInr数据库中进行搜索，鉴定差异蛋白质的种类并采用western blot方法进一步验证。
　　 结果：
　　 1.蕨麻正丁醇部位对大鼠急性心肌缺血再灌注损伤的保护作用：（1）各组心电图ST段变化：模型组心电图ST段发生明显偏移。与模型组相比，中高剂量蕨麻正丁醇部位给药组和复方丹参药物组心电图ST段变化幅度明显降低。（2）HE染色：模型组组织病理学改变显著，心肌间质出现炎细胞浸润，心肌纤维嗜酸性变，肌节断裂，坏死；蕨麻高、中剂量组心肌损伤程度较模型组减轻，低剂量组与模型组比较未见明显改善。（3）心肌超微结构的变化：电镜结果显示蕨麻正丁醇高剂量组能够减轻心肌细胞缺血再灌注损伤导致的线粒体肿胀、空泡化，核周间隙扩增等超微结构的损伤改变，维持相对整齐的心肌纤维排列。（4）血清LDH、CK检测：与模型组相比，给予中高剂量蕨麻正丁醇部位均可显著降低缺血再灌注大鼠血清LDH活性（P<0.01）和CK活性（P<0.01）；（5）血清MDA、SOD检测：与模型组相比，各浓度蕨麻正丁醇部位均可显著提高缺血再灌注大鼠血清中SOD活力（P<0.01），减少MDA的产生（P<0.01、），且呈现一定的浓度依赖性。
　　 2.大鼠心肌组织蛋白双向电泳图谱分析
　　 经PDquest软件分析检测到的各组总蛋白点数：对照组1003±23，丹参组918±65，低剂量组877±72，中剂量组1046±43，高剂量组891±23，模型组738±69。分离的蛋白点多分布于P14.8-9.0、MW30kDa-70kDa的范围。模型组与手术对照组比较（P<0.05），其中分析后表达升高的有5个点，降低的有39个点，45个点未见表达。在表达升高的5个点中有1个点被蕨麻正丁醇部位高，中剂量组及复方丹参组下调。在模型组未见表达的45个点中，能被三个剂量组共同上调的有6个点，复方丹参组有3个点与蕨麻正丁醇部位相同。在表达降低的39个点中，能被三个剂量组及复方丹参组共同上调的有4个点。
　　 3.差异蛋白质的质谱鉴定
　　 对取得的7个差异蛋白质点进行MALDI-TOF质谱鉴定，得分均大于61分（P<0.05），可以确认蛋白质种类。分别为αB晶体蛋白（alpha B-crystallin）、磷脂酰乙醇胺结合蛋白（phosphatidylethanolamine binding protein，PEBP）、辅酶Q10（NADH dehydrogenase1 alpha10）、载脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）、肌球蛋白轻链3（myosin，light chain3）、肌球蛋白轻链2（Myosin regulatory light chain2），αB晶体蛋白CRA b亚基（crystallin.alpha B，isoform CRA b）
　　 4.Western blot验证
　　 Western blot实验显示，辅酶Q10在心肌细胞中存在表达，且该蛋白在心肌缺血再灌注损伤后以及药物干预后表达的变化趋势与双向电泳图像经PDQuest软件分析后得到的蛋白质变化趋势相一致。
　　 结论：
　　 1.蕨麻正丁醇部位能够改善急性心肌缺血再灌注所致的心肌组织形态的病理改变，保护心肌组织的超微结构，其作用与其清除自由基的能力有关。
　　 2.心肌缺血再灌注损伤可引起心肌蛋白质表达变化，其中部分差异蛋白可被药物干预向对照组的方向调节，提示组织中出现的差异蛋白质中部分可能为心肌损伤诱导的基因表达产物及药物作用靶点。
　　 3.经过验证，蕨麻正丁醇部位能通过上调辅酶Q10蛋白，减少自由基的产生，减轻膜脂质过氧化保护损伤，从而减轻心肌缺血再灌注损伤。
　　 4.在各组检测到的差异性蛋白，可能是再灌注损伤及用药后特异性表达的生物标志蛋白，对其进行进一步研究，有望深入了解蕨麻正丁醇部位保护再灌注损伤的分子机制。

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综述 蛋白质组学技术在心血管疾病研究中的应用

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