CD4CD25调节性T细胞特异性标志物Foxp3在慢性乙型肝炎发病中的免疫机制

摘要

目的：乙型肝炎的发病机制与机体的免疫功能密切相关，目前认为CD4+CD25+调节性T细胞（Treg cell）是机体免疫系统维持免疫耐受的重要调节者，可能参与乙型肝炎病毒感染慢性化的过程。本研究观察慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞中Treg细胞特异性标志物Foxp3 mRNA的表达水平，以及Foxp3蛋白在活检肝组织中的表达及定位情况，并分析其与肝组织损伤程度（包括肝组织炎症活动度及血清转氨酶水平）、病毒载量及纤维化的相关性，探讨CD4+CD25+调节性T细胞在慢性乙型肝炎发病中的特性及作用机制，为慢性乙型肝炎免疫耐受建立的主动调节机制提供有力证明，并为研究慢性乙型肝炎发病机制和治疗方法提供理论依据。
　　 方法：
　　 1.病例选择：所有入选病例均为石家庄市第五医院住院或门诊的慢性乙型肝炎患者，共计103例，其中男74例，女29例，年龄13～70岁，平均年龄37.8±16.3岁。所有患者血清学指标均HBsAg阳性，HBeAg或抗-HBe阳性，HBV DNA阳性或阴性。均进行肝穿刺活组织检查，同时肝穿前两日内抽取外周抗凝血2ml。诊断符合2005年中华医学会肝病学分会、感染病学分会制定的《慢性乙型肝炎防治指南》标准[2]，并以病理分级（G）进行分组，其中G1组26例， G2组28例， G3组25例， G4组24例；正常对照组（G0）16例，取自于肝血管瘤或单纯胆囊切除术中后正常组织。所有患者均排除甲、丙、丁、戊型病毒性肝炎重叠感染，并排除酒精性肝病、脂肪肝、自身免疫性肝病和药物性肝炎等其它肝病。所有受试者血小板计数均>70×109，凝血酶原活动度>60％，无肝穿活检禁忌。
　　 2.主要实验方法：所有患者于肝穿刺活检前两日内抽取空腹静脉血行肝功能、凝血酶原活动度（PTA）、乙肝五项、HBVDNA定量检测。同时收集进行肝组织活检的患者外周EDTA抗凝血2ml，淋巴细胞分离液分离单个核细胞，提取单个核细胞的RNA，进行逆转录cDNA，real-time FQ-PCR技术扩增检测FoxP3mRNA。
　　 入选病例均行肝脏活体组织穿刺检查，分别进行HE、Masson、网织纤维染色，并进行炎症活动度分级（G）和纤维化分期（S）；免疫组织化学染色检测不同病理分级患者肝组织中Foxp3的表达变化及定位特点，数据处理应用SPSS13.0统计软件进行统计学分析。
　　 结果：
　　 1.外周血单个核细胞中Foxp3mRNA水平测定：外周血Foxp3 mRNA在不同病理分级（G1-G4）组表达水平分别为（3.59±0.45）、（3.67±0.62）、（3.70±0.45）、（4.42±0.35），均高于正常对照组（3.25±0.20）（P<0.05），同时G4组Foxp3mRNA表达水平均高于G1、G2、G3组（P<0.05），但G1、G2、G3组相比差异无统计学意义。
　　 2.Foxp3蛋白在不同组肝组织中的表达变化：Foxp3主要表达在浸润于汇管区、小叶肝窦及炎症坏死区内的CD4+CD25+调节性T淋巴细胞，阳性细胞呈棕黄色至深褐色。按炎症活动度级别分组：G0级，Foxp3不表达或仅见于个别散在于汇管区及肝窦内淋巴细胞；G1和G2级，在汇管区可见到少量至中等量Foxp3阳性表达的淋巴细胞浸润，同时在小叶肝窦内及炎症坏死区有少至中等量表达；G3、G4级，在汇管区可见到中等量至大量Foxp3阳性表达的淋巴细胞浸润，同时小叶肝窦内及炎症坏死区的Foxp3阳性表达的淋巴细胞有少至中等量的增加。
　　 3.Foxp3蛋白在肝组织汇管区及小叶内半定量分析结果：设G0组为对照组，G1、G2、G3、G4组为病例组，在CHB患者汇管区的Foxp3分值较G0明显增加，其差异具有显著的统计学意义（P<0.01）；同时，随着病理分级的逐渐增加其表达也逐渐增强（r=0.561，P<0.05）；CHB患者肝小叶内Foxp3的分值亦高于正常对照组（P<0.05），但是随着病理分级的逐渐增加，Foxp3的表达未见明显增强（r=0.316，P>0.05）；不同纤维化分期与Foxp3表达的相关分析显示，Foxp3在汇管区及小叶内的表达与肝组织纤维化增生程度（S）无相关性（P>0.05）。
　　 4.肝组织Foxp3表达与ALT、HBV DNA的关系：Foxp3在CHB患者肝组织汇管区及小叶内的表达与血清中ALT水平及HBV DNA载量之间均无相关性（P值均>0.05）。
　　 结论：
　　 （1）慢性乙型肝炎患者不同炎症分级Foxp3mRNA水平均高于正常对照组，并且病理分级G4组Foxp3mRNA水平明显高于其他各组，提示外周血单个核细胞Foxp3mRNA表达水平可能与疾病的损伤程度及预后密切相关。
　　 （2）在正常肝组织中的Foxp3在汇管区及小叶内基本不表达；而在CHB组中，随着炎症活动度的逐渐增加，Foxp3在汇管区阳性表达逐渐增加，但随着炎症活动度的逐渐增加，在肝小叶内的阳性细胞数并无明显增加。
　　 （3）肝组织Foxp3在CHB患者肝组织汇管区及小叶内的表达与不同肝纤维化分期、血清中ALT水平及HBV DNA载量之间均无相关性。
　　 综上所述，随着炎症活动度的不断增加，CHB患者肝组织中Foxp3表达水平在汇管区显著升高，Treg的升高与肝组织炎症活动度呈显著正相关。由此推测炎症活动度越明显，机体通过产生更多的Treg细胞，以抑制过度的免疫病理损伤，从而能够有效地抑制自身反应性T细胞，因此，Treg具有主动调节的抑制作用，起到平衡对HBV感染清除和肝组织损伤之间的重要作用，对慢性乙型肝炎的抑制反应可能对减轻免疫损伤起到了积极的意义。迁延不愈的免疫损伤可能与机体缺少足够的Tregs抑制有关。

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结果

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附表

讨论

结论

参考文献

综述 CD4+CD25+调节性T细胞在免疫调节中的特性及作用机制

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